论文部分内容阅读
肠激酶(Enterokinase,EK)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。由于其酶切的高度特异性,酶解后可保证目的蛋白N-末端氨基酸序列的完整性,从而使得肠激酶成为基因工程领域融合蛋白表达后修饰的首选工具酶之一。本研究通过基因工程手段,成功构建了重组牛肠激酶载体pPIC9K-BEKL。经G418抗性梯度筛选获得了5株不同抗性水平的菌株并借助QPCR技术,对其基因拷贝数进行了鉴定,结果显示菌株抗性水平及肠激酶表达量与外源基因拷贝数呈正相关。随后,采用多因素优选法对筛选所得的菌株进行了表达条件优化,并利用镍离子亲和层析的方法对发酵产物进行分离纯化。结果显示,经毕赤酵母表达所得的重组型牛肠激酶分子量约为43kDa,糖基化程度约为20.9%。纯化后,每1L发酵液获得5.7mg具有活性的目的蛋白,采用切割融合蛋白的方法测定纯化后牛肠激酶的比活达1.25×103U/mg,动力学常数Km=0.59mM,kcat=45.1S-1。以牛肠激酶轻链作为研究对象,尝试利用理性设计的方法以提高其热稳定性。首先综合Gromas 4.5.5、B-Factor及Flex Service等不同考评蛋白柔性区软件的分析结果,确定出肠激酶的结构灵活区Fragment 63-69,Fragment 85-93及Fragment135-139,并通过添加脯氨酸或二硫键的方法来对蛋白的灵活区进行刚化。根据β-转角内序列统计信息及引入位置原有的残基不参与形成氢键的原则确定了三株脯氨酸突变体S67P,R87P及Y136P。结合肠激酶结构信息及Disulfide by Design软件预测结果,确定了三株添加二硫键突变体:C5-C146,C85-C88及C73-C98。利用Quick-change定点突变的方法引入突变位点,并通过在毕赤酵母中表达成功获得了6种不同突变体蛋白。在对野生型及突变型牛肠激酶的热稳定性测定后发现,添加二硫键后的突变体(C5-C146,C85-C88及C73-C98)及脯氨酸突变体(R87P),其失活半衰期(t1/2)和半失活温度(T5010)较野生型均有了显著提高。同时,对R87P及C85-C88突变体酶活测定结果表明,突变体酶催化效率(Km/kcat)与野生型相比未发生明显改变。本研究成功构建了高产牛肠激酶轻链表达菌株,并利用理性设计的方法策略,提高了牛肠激酶的热稳定性同时保持其活性不受影响。该策略扩宽了肠激酶在基因工程领域中的应用,并为其他工业用酶的热稳定性改造提供了可借鉴的思路。