正性转录延伸因子P-TEFb是由CDK9及其调节亚基Cyclin T1组成的异二聚体激酶,广泛存在于真核生物中。研究证明:P-TEFb是基因转录从起始阶段进入到有效延伸阶段的必需因子,与艾滋病、心肌肥大和肿瘤发生均有密切的关系。在RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)主导的mRNA转录过程中,P-TEFb被选择性募集到基因启动子区,进而磷酸化PolⅡ及延伸抑制因子,刺激全长mRNA的高效转录。在真核细胞内,P-TEFb以无活性和有活性(可募集)两种复合物形式存在。本实验室的前期研究发现,细胞在受到外界胁迫因素刺激后,可以激活细胞内钙离子依赖性蛋白磷酸酶PP2B以及蛋白磷酸酶PPl两条信号途径,通过蛋白磷酸酶PP2B和PP1的协同去磷酸化作用,致使无活性复合物解离,从而释放P-TEFb。被释放的P-TEFb通过与募集因子溴结构域蛋白Brd4的结合、被选择性的募集到基因启动子区,调节相关基因的转录。可见,Brd4对于P-TEFb的募集和发挥调节转录功能起到了至关重要的作用。因此,Brd4调控P-TEFb募集机制的研究对于我们深入研究基因表达具有非常重要的意义。Brd4的两个串联的溴结构域可通过识别核小体乙酰化组蛋白而结合于染色质上。我们前期报道已证明,当细胞受到刺激后,Brd4可以从染色质上解离下来,进而与已经活化的P-TEFb结合,并将P-TEFb募集到基因启动子区,从而调控应激性基因的转录表达(我们将该过程称为Brd4的应激活化);并发现用特异的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂TSA预处理细胞,会抑制Brd4的应激活化,显示HDACs信号途径参与了这个过程。在哺乳动物细胞中,共有11个HDACs基因,分为4大类。然而调控Brd4应激活化的特异HDACs类型还不清楚。　　 本文研究目标是甑别与鉴定调控Brd4应激活化相关HDACs信号途径的特异HDACs类型。我们首先采用MS-275预处理细胞,发现可以抑制Brd4的应激活化。MS-275是针对HDACⅠ类(主要是HDAC1,2,3)的特异性抑制剂,因此我们推测上述现象的发生是与HDACⅠ类有关的。为了检验这个推测,我们克隆了针对HDAC1,2,3的shRNA,采用病毒包装感染细胞抑制HDAC1,2,3的表达。结果发现单抑制其中一个或两个HDACs都不能阻断Brd4的应激活化,必须是同时抑制三个HDACs才能起到阻断效果。表明HDAC1-3都参与了Brd4应激活化的调控。接下来我们用过表达无活性HDACs(即对HDACs进行定点突变),发现过表达HDAC1+3或2+3均可阻断Brd4的应激活化,而过表达HDAC1+2则不能抑制这个过程。这些结果显示HDACs具有功能性冗余。有趣的是,这也说明无活性HDAC3突变体与无活性HDAC1或2突变体共同作用就足以抑制信号引起的Brd4应激活化,提示HDAC1和HDAC2可能共用一个调节亚基或是两者形成了一个复合物。意外的是,共表达HDAC1,2,3并不能直接导致Brd4的活化。提示Brd4的应激活化可能还需要另外一条途径的协同或过表达的HDAC1,2,3本身也需要被应激活化,才能有效调控Brd4的活化。尤其令人兴奋的是,我们发现MS-275可显著增强DOX诱导的细胞凋亡,提示了HDACs抑制剂可能被用来加速化学治疗中使用的细胞毒素像阿霉素(DOX)等引起的肿瘤细胞凋亡,因此,Brd4应激活化的调控机制可作为筛选治疗肿瘤的潜在药物靶点。　　 综上所述,我们的结果显示Brd4应激活化需要HDACⅠ类(HDAC1,HDAC2,HDAC3)的参与,同时显示抑制这个过程将强化化学治疗的效力。