天然扩展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase, PEL)的催化特性有其自身的特色,但其在热稳定性、有机溶剂耐受性等方面,还不能很好地满足实际应用的需求。本文利用定点饱和突变技术对PEL的特定位点进行改造,筛选得到PEL突变体,借助毕赤酵母表达系统进行表达,并对其酶学性质进一步分析与鉴定,旨在提高酶的热稳定性和有机溶剂耐受性,为其进一步应用提供更好的酶源。具体研究内容和主要结果如下：1、突变体库建立和高活性突变株筛选设计简并引物,对扩展青霉脂肪酶的92位点进行定点饱和突变,PCR扩增后在原核表达系统中表达,并用三丁酸甘油酯乳化液平板筛选突变株,初步得到1株稳定性高高于野生型脂肪酶的突变株：D92E。同时,根据筛选的结果和半理性设计的方法,设计了三个定点突变实验,得到三个突变株：T66E、N73Q和D151E。2、突变体的表达及其酶学性质分析将筛选得到的脂肪酶突变体连接到表达载体pPIC3.5k上,得到四个重组质粒pPIC3.5k-PEL-D92E、pPIC3.5k-PEL-T66E、pPIC3.5k-PEL-N73Q和pPIC3.5k-PEL-D151E。用Sal线性化这四个重组质粒,并电转至毕赤酵母GS5,甲醇诱导表达。然后对其热稳定性及有机溶剂稳定性进行了分析与鉴定。主要结果如下：(1)与野生型脂肪酶相比,突变体D92E热稳定性得到较明显的提高,在50℃处理10min后,野生型脂肪酶的残余酶活只有31.72%,而突变体D92E脂肪酶的残余酶活为70.28%；突变体D151E比野生型脂肪酶的热稳定性稍有提高,提高不明显；突变体T66E和N73Q比野生型脂肪酶的热稳定性均下降明显。(2)突变体D92E和D151E比野生型脂肪酶的乙醇耐受性均有所提高,加入乙醇37℃孵育10 min后,突变体D92E脂肪酶的残余酶活为88.32%,突变体D151E脂肪酶的残余酶活为95.47%,野生型脂肪酶的残余酶活为62.06%；突变体T66E和N73Q比野生型脂肪酶的乙醇耐受性均下降明显。