研究背景和目的结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，近十年来，结直肠癌在我国的发病率呈逐年上升的趋势。转移是影响患者治疗效果和死亡的主要原因，探讨与结直肠癌转移相关的因素，寻找预防和治疗的有效途径，是当代肿瘤学研究的一项迫切任务。在我们的前期研究中，利用自行研制的含有447个已知肿瘤转移相关基因cDNA芯片，筛选出51个结直肠癌转移相关基因。应用文献轮廓挖掘微阵列表达数据的生物信息学方法，筛选出4个与结直肠癌转移密切相关的新基因，并对其中一个新的结直肠癌转移相关基因—T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（T lymphoma invasion and metastasis，Tiaml），在RNA水平进行了初步验证。Tiaml是鸟苷酸转换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）家族成员，GEFs的主要功能是调节Rho GTPase的活性。Rho GTPase家族包括Rho、Rac及Cdc42，是Ras超家族的成员。Tiaml体内外均可以特异性地激活Rho GTPase家族中的Racl。新近的研究发现Tiaml不但激活Rac，更重要的是Tiaml直接与胞浆和胞膜上的蛋白质相互作用，将它们耦合到Tiaml-Rac信号通路上，从而影响Rac信号通路的特异性。Tiaml基因最初在小鼠T淋巴瘤细胞高侵袭变异株中分离鉴定。随后，在乳腺癌、肺癌及Ras诱导的皮肤癌等肿瘤证实Tiaml具有明显的促进肿瘤进展和转移的作用。在Tiaml敲除的动物模型中，小鼠皮肤癌发生率明显减低并且肿瘤进展缓慢，Malliri等认为Tiaml在Ras诱导皮肤癌发生的启动和进展阶段发挥关键作用，这一效应与Tiam1表达量有明显的关系。上述的研究表明，Tiam1是多种肿瘤的促癌基因和促进转移基因。本研究重点探讨Tiam1基因对结直肠癌增殖、侵袭及转移的影响和作用机制，阐明Tiam1在结直肠癌转移中的主要生物学功能，为结直肠癌转移的早期诊断和治疗奠定理论基础。方法1．结直肠癌组织中Tiam1的表达及临床意义应用免疫组化S-P法，检测157例结直肠癌和配对的30例正常结直肠黏膜、35例结直肠癌区域淋巴结转移癌以及32例结直肠腺瘤组织中Tiam1蛋白的表达。2．Tiam1过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响用RT-PCR方法检测Tiam1基因在9种结直肠癌细胞株中的表达，筛选Tiam1不表达的细胞株；将Tiam1／C1199HA cDNA导入内源性不表达Tiam1基因的人结直肠癌HT29细胞株中，G418筛选抗性单克隆，RT-PCR、免疫组化及Western blot鉴定转染后Tiam1基因在细胞中的表达；观察Tiam1基因转染前后，细胞增殖、体外侵袭、成瘤能力及体内转移能力的变化。3．建立整体可视化结肠癌原位及转移动物模型利用阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000将pEGFP-N1质粒导入人结直肠癌SW480细胞，获得稳定表达绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的细胞株SW480／EGFP⁺；通过结肠癌原位手术移植的方法建立结肠癌原位及转移模型，利用肿瘤细胞表达EGFP的特点，借助整体荧光体视镜结合IPP5.0软件采集、分析EGFP发出的荧光信号，在动物活体实时观察结肠癌局部成瘤及转移情况；利用MTT法检测和分析EGFP对细胞增殖能力的影响；应用病理学方法对结肠癌原位及转移动物模型进行评价和鉴定。4．Tiam1表达沉默对结直肠癌细胞生物学特性的影响设计Tiam1干扰片段，构建含U6启动子的慢病毒载体，将慢病毒载体质粒与辅助质粒共转染293FT病毒包装细胞，收集病毒上清，进行病毒滴度测定，用慢病毒感染结直肠癌细胞，用RT-PCR和Western blot鉴定有效的干扰载体。用含Tiam1特异性干扰片段的慢病毒感染SW480／EGFP⁺细胞，用含空载体的病毒做对照。用杀稻瘟菌素筛选抗性克隆，挑取抗性单克隆，荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰后Tiam1基因在细胞中的表达；利用MTT法、平板克隆形成实验检测Tiam1对细胞体外增殖的影响、体外侵袭实验检测Tiam1对结直肠癌侵袭能力的影响、在裸鼠体内观察Tiam1对结直肠癌细胞致瘤能力的影响及利用可视化结直肠癌原位动物模型观察Tiam1对结直肠癌细胞体内转移能力的影响。5．利用基因芯片和比较蛋白质组学技术分析Tiam1在结直肠癌增殖、侵袭和转移中的作用利用Affymetrix公司的寡核苷酸芯片（47，400个转录本，包含38，500个已知基因）检测Tiam1基因表达沉默后差异基因表达谱。应用Gene Ontology、MILANO、Panther、Genomatix等软件进行生物信息学分析。利用蛋白质组学技术分离HT29／Tiam1和HT29／mock细胞、SW480／EGFP⁺／Tiam1^-和SW480／EGFP⁺／mock细胞的总蛋白，建立重复性和分辨率较好的细胞双向凝胶电泳图谱，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异表达的蛋白质点。利用软件过滤基线峰、识别信号峰，利用Matrixscience公司的在线软件Mascot Distiller进行搜索分析。利用荧光定量PCR、Western blot方法对所获得的差异基因和／或差异蛋白质进行鉴定。结果1．结直肠癌组织中Tiam1蛋白的表达免疫组化结果显示Tiam1在正常结直肠黏膜、腺瘤、癌和淋巴结转移癌四种类型的组织中表达明显不同，差异具有显著性（x²=23.561，P＜0.01），两两比较发现，腺瘤Tiam1表达比正常结直肠黏膜组织强（Z=-2.423，P＜0.05），淋巴结转移癌组织Tiam1表达比结直肠癌组织强（Z=-2.051，P＜0.05），而结直肠癌组织与腺瘤组织Tiam1表达差异无显著性（Z=-0.938，P＞0.05）。在结直肠癌组织中，伴发区域淋巴结转移的癌组织比未发生转移的癌组织Tiam1表达明显增强，差异具有显著性（Z=-3.176，P＜0.01）。研究结果提示，Tiam1蛋白表达与结直肠癌转移高度相关，即Tiam1表达弱或阴性者转移的发生率低，表达强者其转移发生率高。2．Tiam1质粒的转染及建立稳定表达Tiam1的结直肠癌细胞株应用RT-PCR检测9种结直肠癌细胞株Tiam1基因的表达，发现HT29细胞内源性不表达Tiam1基因。将Tiam1质粒导入HT29细胞中，挑取G418抗性单克隆，RT-PCR及Western blot确定Tiam1在转染克隆1中表达最强（命名为HT29／Tiam1），Tiam1在空载体对照中不表达（命名为HT29／mock）。3．Tiam1过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响通过MTT法，我们检测了Tiam1对结直肠癌细胞体外增殖能力的影响，与HT29／mock细胞相比，HT29／Tiam1细胞的增殖能力明显增强（F=239.197，P＜0.01）。此外，接种HT29／Tiam1细胞的裸鼠皮下肿瘤生长明显加快（F=48.410，P＜0.01），肿瘤体积自皮下注射后的第七天起出现显著性差异，接种HT29／Tiam1细胞的裸鼠皮下肿瘤第20天的平均体积是HT29／mock细胞组的2.5倍。进行结直肠癌细胞外科原位移植6周后，接种HT29／Tiam1细胞的裸鼠结肠原位肿瘤重量明显大于接种HT29／mock细胞的裸鼠（t=-14.916，P＜0.01）。体外侵袭实验证明，肿瘤细胞侵袭实验24h后，HT29／mock和HT29／Tiam1细胞均穿透基底膜向下侵袭，在聚碳酸酯膜上可见变形的肿瘤细胞，HT29／Tiam1细胞侵袭能力是HT29／mock细胞的1.9倍，说明Tiam1基因的表达增强了结直肠癌细胞的侵袭能力。采用外科原位移植的方法比较HT29／mock和HT29／Tiam1细胞的体内转移能力。在HT29／Tiam1细胞组，100％（7／7）裸鼠发生了腹腔转移、57.1％（4／7）发生了肝转移、其中有一只裸鼠发生了广泛转移，包括脾、肺及淋巴结等转移。在HT29／mock细胞组，只有29％（2／7）裸鼠发生了腹腔转移，没有一只裸鼠发生远处转移。4．整体可视化结肠癌原位及转移动物模型观察本研究建立的结直肠癌细胞株SW480／EGFP⁺稳定、高效的表达绿色荧光蛋白，且增殖能力与SW480相比，没有显著性差异（F=1.171，P＞0.05）；采用外科手术原位移植的方法建立结肠癌可视化原位动物模型，成功率达到100％。移植2周后，结肠原位成瘤，未发现有转移情况，手术6周后，75％的裸鼠发生了腹腔转移，50％发生了肝转移。通过病理学方法，验证了可视化原位及转移动物模型的可靠性。5．通过RNAi技术沉默结直肠癌细胞株Tiam1表达，建立Tiam1基因稳定沉默的结直肠癌细胞株构建了四个干扰Tiam1基因表达的慢病毒干扰载体，将慢病毒质粒和辅助质粒共转染293FT病毒包装细胞，收获病毒上清，测定病毒滴度为7×10⁵Transducing Unit（TU）／ml。利用慢病毒感染SW480／EGFP⁺细胞，荧光定量PCR和Western blot结果发现含片段B的慢病毒干扰载体的干扰效率最高（73％）。利用含干扰片段B的慢病毒和空载体病毒感染SW480／EGFP⁺细胞，挑取杀稻瘟菌素抗性单克隆，荧光定量PCR和Western blot结果发现Tiam1在干扰克隆2中表达降低最明显（命名为SW480／EGFP⁺／Tiam1^-），干扰效率达88％。6．Tiam1基因表达沉默后对结直肠癌细胞生物学特性的影响MTT法观察Tiam1基因表达沉默后体外细胞的增殖情况，与SW480／EGFP⁺／mock和SW480／EGFP⁺细胞相比，SW480／EGFP⁺／Tiam1^-细胞的增殖速度明显减慢，并且呈时间依赖关系（F=3.361，P＜0.01）。平板克隆形成实验显示SW480／EGFP⁺／Tiam1^-细胞的活力显著下降，差异有统计学意义（F=7.244，P＜0.05）。这些结果均说明Tiam1表达水平减低后，肿瘤细胞体外生长被显著抑制。体外侵袭小室检测Tiam1基因表达沉默后细胞侵袭能力的改变，结果显示，与SW480／EGFP⁺／mock和SW480／EGFP⁺细胞相比，SW480／EGFP⁺／Tiam1^-细胞的侵袭能力明显降低，差异具有显著性（F=45.645，P＜0.01），说明Tiam1表达沉默明显抑制了结直肠癌细胞的体外侵袭能力。通过结直肠癌可视化动物模型，我们观察了Tiam1基因表达沉默后对结直肠癌增殖和转移能力的影响。将结直肠癌细胞接种于裸鼠的皮下，通过30天连续的观察，我们发现Tiam1基因表达沉默后，显著性地抑制了结直肠癌细胞的体内增殖能力（F=2.256，P＜0.05），增殖差异从第15天开始，到第30天，差异达到1.3倍。将Tiam1表达沉默的细胞接种于裸鼠结肠原位后，细胞的转移能力受到了限制。在SW480／EGFP⁺／mock组，75％（6／8）裸鼠发生了腹腔转移，37.5％（3／8）裸鼠出现肝转移，12.5％（1／8）形成肺转移，而在SW480／EGFP⁺／Tiam1^-组只有37.5％（3／8）形成腹腔转移，未发现裸鼠形成远处转移。7．利用基因芯片技术探讨Tiam1在结直肠癌增殖、侵袭、转移中的作用利用Affymetrix公司的HG-U133 plus 2寡核苷酸芯片对SW480／EGFP⁺／Tiam1^-和SW480／EGFP⁺／mock细胞的基因表达谱进行分析，获得Tiam1相关基因1026个，包括与Tiam1作用协同的基因647个，作用拮抗的基因379个。对获得的基因进行功能分类发现，与Tiam1基因协同作用的基因主要涉及了细胞周期、细胞周期调控、DNA复制、核苷酸代谢、调节细胞生理过程等，与Tiam1基因拮抗作用的基因主要涉及了生物过程负调控、抑制酶活性、细胞过程的负调控基因等。对获得的基因进行信号通路分类发现，参与Tiam1调节作用的基因主要涉及了Wnt通路、p53通路、凋亡信号通路、整合素信号通路、P13K信号通路、Ras信号通路等。8．利用比较蛋白质组学技术分析Tiam1在结直肠癌增殖、侵袭、转移中的功能比较蛋白质组学是当前蛋白质组学研究的主要策略，通过比较细胞在基因转染前后／沉默前后蛋白质表达差异，发现与目的基因作用相关的蛋白质。在本研究中，与HT29／mock细胞相比，HT29／Tiam1细胞表达的蛋白质在数量和表达水平上发生了一定变化，而这些发生改变的蛋白质与Tiam1的促进转移作用相关；SW480／EGFP⁺／Tiam1^-细胞为通过RNAi技术使Tiam1表达沉默的细胞，其表达的蛋白质与SW480／EGFP⁺／mock细胞相比，在数量和表达水平上亦发生了一定的变化，而这些发生改变的蛋白质亦与Tiam1的促进转移作用相关。因此，利用比较蛋白质组学的方法，分析这些细胞蛋白质表达的变化，可发现与Tiam1作用相关的蛋白质，从而了解其发挥作用的分子机制。在本研究中，利用蛋白质组学技术分离细胞的总蛋白，结合图像分析和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对部分差异表达的蛋白质点进行鉴定，共鉴定了20个差异表达的蛋白质点。我们对鉴定的蛋白质的功能进行分类，主要为与细胞代谢、细胞增殖、细胞骨架结构相关的蛋白，以及分子伴侣和未知功能的蛋白。这些差异蛋白质中有一些同肿瘤的增殖、转移密切相关。9．Tiam1差异基因和／或蛋白质筛选过程中的转录组和蛋白质组的对接在本研究中，我们利用基因芯片和比较蛋白质组学技术筛选与Tiam1作用的基因和／或蛋白质，转录组和蛋白质组对接的基因／蛋白质有3个，2个是与Tiam1基因功能协同的高迁移率族蛋白B1（high motility group box 1，HMGB1）和磷酸甘油酸变位酶（phosphoglycerate mutase，PGAM1），他们随着Tiam1基因的表达上调而上调，表达沉默而下调；另一个是与Tiam1基因功能拮抗的膜联蛋白4（annexin A4，ANXA4），它随着Tiam1基因的表达上调而下调，表达沉默而上调。结论1．Tiam1基因是结直肠癌增殖、侵袭、转移的促进基因；2．Tiam1可能参与多条信号通路来介导它在结直肠癌中的作用，在相互作用的基因中HMGB1、PGAM1和ANXA4与Tiam1关系密切，他们是Tiam1信号通路中的新基因。本研究的创新之处1．建立了整体可视化结直肠癌原位及转移动物模型，为结直肠癌的实验研究提供了理想的实验工具；2．利用慢病毒载体和RNAi技术建立了稳定的Tiam1基因表达沉默的结直肠癌细胞株及Tiam1基因表达沉默的结直肠癌原位动物模型，为结直肠癌转移机制研究提供实验手段；3．将芯片技术、比较蛋白质组学技术相结合，实现了转录组和蛋白质组的对接；4．将RNAi技术、基因芯片技术、蛋白质组学技术相结合，用于Tiam1基因的功能研究，为阐明Tiam1在肿瘤转移中的作用提供新的证据，并综合分析Tiam1的信号转导通路，发现3个参与Tiam1信号通路新的成员。