运动是机体一项复杂的行为活动,需要多个脑区共同参与。其中,运动皮层是运动控制的高级中枢,在运动的准备和执行等环节中发挥着关键性作用。初级运动皮层(M1)是运动皮层的核心区域,其内第5层椎体神经元与脊髓存在大量的神经联系,可以直接向脊髓下达运动指令并控制运动的执行。视觉皮层是调控机体运动行为的另一个重要脑区,与运动皮层有着大量的神经联系。其中的初级视觉皮层(V1)接受来自外界环境的视觉输入,对个体的自身定位和运动行为的指引有重要意义。然而目前,两个皮层在运动过程中对信息处理和编码的机制仍不清楚。排尿行为不仅是人和动物的一项基本生理功能,也是一项复杂社会行为,它涉及膀胱的两个过程:储存和排空。排尿反射是膀胱的排空过程中的关键关节,需要神经系统中的多个区域的共同调控。排尿反射是一条由脊髓-延髓-脊髓介导的神经环路,环路上有一个关键性的脑区脑桥排尿中枢(PMC)。脑桥排尿中枢是目前研究明确所知的控制排尿的中枢区域。它的激活会引起尿道膀胱逼尿肌收缩、平滑肌的松弛进而使尿液流出膀胱。但是,排尿行为作为一种高度可控的行为,还应该受到更高级中枢的控制,如大脑皮层。但目前的研究尚未发现有确切控制排尿功能的皮层区域。传统的用于研究皮层信息编码和处理的方法是监测单个神经元的活动。然而,长期以来,研究神经元集群的活动是另一种解析皮层的工作模式的重要方式。大量研究已经证明,集群的神经元活动参与脑的多种功能并扮演重要角色,如神经系统发育、感觉信息处理以及学习和记忆等。常用的监测脑集群神经活动的方法有局部场电位、功能磁共振和双光子钙成像等。但以上方法存在空间分别率不足、成像深度过浅或者不能在自由清醒动物身上记录等限制。近几年,一种名为光纤记录的集群钙信号记录方法得到了快速发展和应用。它是一种操作方便、高效、可用于自由运动动物深部脑区记录的钙信号监测方法。综合以上信息,在本文中我们采用光纤记录的方法,监测运动和排尿行为过程中动物大脑皮层集群神经元的钙活动情况,试图解析皮层在运动和排尿过程中信息处理和编码的神经机制。本文主要发现如下:1.不同麻醉深度对小鼠大脑皮层集群钙信号的影响。麻醉对大脑活动状态的影响涉及多个层次,小至单个神经元大到全脑水平,但麻醉对小规模局部神经元集群的影响仍所知甚少。因此,在本文中我们选取初级运动皮层(M1)和初级视觉皮层(V1)作为研究区域。我们在M1区或V1区第5层注射钙染料OGB-1AM,并用光纤记录注射区域的钙信号变化。在M1区,我们分别在5个不同的麻醉深度(2%, 1.5%, 1.2%, 1%, 0.8%)下进行了钙信号记录,而在V1区,我们仅在0.8%深度下进行了记录。(1)不同麻醉深度对皮层集群钙信号频率特征的影响。随着麻醉浓度的降低,M1区的钙信号的发放频率逐渐升高,从2%的0.044 ±0.013 Hz升高到0.8%的0.477 ± 0.0026 Hz,而且相邻两种麻醉深度下的钙信号频率有统计学差异(p<0.05)。相同麻醉深度下,M1区与V1区的钙信号频率没有显著差别(p = 0.051 )。(2)不同麻醉深度对皮层集群钙信号幅度特征的影响。不同麻醉深度对钙信号幅度的影响则与频率相反。随着麻醉浓度的降低,M1区的钙信号幅度也随之降低,从2%的0.052 ± 0.012 △F/F降低到0.8%的0.016 ± 0.009 △F/F(△F/F代表荧光强度变化),而且相邻两种麻醉深度下的钙信号幅度有统计学差异(p<0.05)。同样的,M1区与V1区的钙信号幅度在相同麻醉深度下没有差别(p = 0.883)。(3)不同麻醉深度对皮层集群钙信号上升时间的影响。钙信号的上升时间非常稳定,既不会被麻醉的变化所影响,也不会受到不同脑区的影响。具体结果如下:在M1区,麻醉浓度下降,上升时间没有明显变化,始终处于0.174 s左右。而0.8%麻醉深度下V1区钙信号的上升时间是0.170 s。综合分析M1和V1的6组数据,没有统计学差异(p=0.320)。上述结果表明,皮层集群钙信号的特征与麻醉深度密切相关,信号频率和幅度表现出明显的浓度依赖特性,而上升时间则与麻醉深度没有明显关联。此外,不同皮层的集群钙信号在相同的麻醉深度下没有明显差别。2.自由运动状态下M1区集群钙信号特点。接下来,我们又记录了清醒小鼠自由运动情况下的M1区集群钙信号,比较了运动与静止状态钙信号的特点,同时分析了钙信号与运动的相关性。(1)运动与静止状态下集群钙信号特点不同。我们仍然选取M1区第5层作为记录位点,待小鼠光纤埋置完毕且麻醉效果已基本消退后,将小鼠放入白色矩形的盒内进行钙信号与行为学的同步记录。通过分析小鼠运动幅度和钙信号,我们发现:当小鼠处于清醒自由运动状态时,可记录到高频发放的钙信号(0.42 ±0.04 Hz),且幅度较大(1.51% ±0.06% △F/F);当小鼠处于静止状态时(但不是睡眠状态),仅有很少信号被记录到(0.08 ± 0.01 Hz),且幅度较小(0.24% ±0.02% △F/F)。在运动与静止状态下,钙信号的频率和幅度均有统计学差异(p< 0.001)。为了排除运动噪声的影响,我们又在Thy1-GFP转基因小鼠M1区的第5层进行了运动与荧光强度的同步记录,结果显示当小鼠运动时,荧光强度只有很小的变化,将OGB-1AM与GFP的荧光强度的分布进行高斯拟合,拟合优度均大于99%,平均值分别为0.3% △F/F和1.5% △F/F,这些结果表明我们记录到的荧光变化不是运动噪声,而是真正的钙信号。(2) M1区集群钙信号与小鼠运动密切相关。我们进一步分析了运动与钙信号的关联性。结果显示:每一个动作必然会伴有相应的钙信号。互相关分析发现运动与钙信号高度相关(P < 0.05),而且钙信号的起始总是超前于运动的起始,超前时间为149.7 ±10.3 ms。将所有超前时间进行高斯拟合,得到拟合中位数约136 ms (n = 8)。上述结果表明,M1区是与运动行为高度相关的脑区,其集群钙信号反应动物的运动行为并超前于运动。3.自由运动状态下V1区集群钙信号特点。以往的研究显示,动物在运动过程中需要视觉信息的输入来进行引导,而且视觉皮层的神经元活动也会受到运动的调节。因此,我们猜想在小鼠V1区也可能存在运动相关的钙信号。(1)运动与V1区集群钙信号密切相关。我们同样在V1区的第5层注射OGB-1AM并记录钙信号。结果显示,在V1区同样存在与M1区相似的与运动高度相关的、并且超前于运动的钙信号。然而,这种V1区运动相关的钙信号要晚于M1区,两者有显著性差异(M1: 149.7 ± 10.3 ms versus V1:50.0±4.7 ms;p<0.001)。同时,我们分析了这两个脑区钙信号的幅度,发现它们并没有差别(p=0.0854)。值得一提的是,在黑暗环境中V1区运动相关的钙信号仍然存在,但是其幅度和运动关联性有所降低(n = 6,p<0.001)。(2) M1区和V1区第5层集群钙信号与头部运动高度相关。人或动物要想朝着一个目标进行运动,必须获取自身位置和目标方向。而在运动过程中,头部运动是感知方向的关键因素。因此,我们猜想头部运动可能与M1区和V1区第5层的集群钙信号密切相关。我们分析了三种头部运动:抬头、转头和缩头。发现:无论哪种头部运动发生,都伴有钙信号的产生。这种钙信号有以下几个特点:在M1区和V1区均能观察到这种钙信号;头部运动必然伴有钙信号,相关率为100%;三种不同头部运动相关的钙信号幅度没有显著性差别(M1:p=0.066,n=8; V1: p = 0.181,n = 7)。以上结果表明V1区是另一个与运动密切相关的重要脑区,其神经活动可能是视觉输入和运动输入的综合体现。头部运动是整个运动过程的重要环节,与M1区和V1区的神经活动紧密相关。4.膀胱的中枢控制区域探索。目前的研究结果显示排尿的控制中枢位于脑桥排尿中心(PMC),然而,是否存在更高级的控制中枢(如大脑皮层)参与排尿的控制,现在仍然没有直接的证据。因此,我们通过在小鼠膀胱壁注射经典的、逆行跨多级神经元的示踪病毒——伪狂犬病毒(PRV),来探索可以与膀胱形成神经网络连接的皮层区域。(1) PRV在小鼠膀胱的标记情况小鼠在病毒注射4-5天后,会表现出明显的神经系统中毒症状,如甩尾、啃咬尾部、行动摇摆等。此时将小鼠膀胱、脊髓和脑组织取出,并切片、染色和成像从而获取形态学结果。在完整的膀胱组织及其切片上,我们可以观察到被PRV标记的神经纤维。这说明我们运用神经示踪方法成功地标记了膀胱壁内的神经纤维。(2) PRV在小鼠脊髓和其他皮层下脑区的标记情况然后,我们又对脊髓和脑组织进行切片观察,在腰髓和骶髓副交感神经核(SPN)、脑桥排尿中枢(PMC)、蓝斑核(LC)、中脑导水管灰质(PAG)以及下丘脑室旁核(PVN)等均发现了被PRV标记的神经元,这些脑区和核团与已经研究报道的、公认的排尿控制相关的区域相一致。以上结果证明,我们的病毒标记方法是可用而有效的。(3) PRV在小鼠大脑皮层的表达情况更重要的是,我们在小鼠的大脑皮层也发现了被PRV标记的一群神经元,通过与经典的小鼠脑图谱对比,显示它们位于初级运动皮层(M1)和初级体感皮层(S1)。统计分析发现,被标记的神经元集群在小鼠大脑皮层前后跨度约为1 mm,并且以前囟(Bregma)向后0.94 mm附近的皮层区域最为密集。被标记的皮层神经元总数量约为1000个;形态上显示大部分为椎体神经元,且80%以上均位于皮层的第5层。5.小鼠大脑皮层排尿行为相关钙信号的记录。虽然我们明确了膀胱与M1区和S1区之间存在神经网络联系,但这两个脑区在排尿过程中的具体功能仍有待研究。因此我们采用光纤记录的方法,探究这两个脑区在排尿过程中的神经活动。(1) M1区神经元钙信号与排尿行为密切相关。我们分别对清醒自由运动小鼠钙染料标记后的M1区与S1区第5层神经元进行钙信号和排尿行为的同步记录。实验结果显示在小鼠排尿时,M1区总会有记录到一个明显的排尿行为相关的钙信号,而这种现象在S1区没有发现。我们又在M1区的前部Ma区进行对照记录,也没有发现这个现象;对比钙信号的幅度发现M1区明显高于S1区与Ma区。故这种排尿行为相关的钙信号具有区域特异性。我们又对钙信号与排尿行为的先后顺序进行了分析,发现钙信号的起始总是超前于排尿行为的起始,平均超前时间约 130 ms。(2) M1区与经典排尿环路的投射关系探索上述结果提示M1区(第5层神经元)可能是一个新发现的与排尿行为密切相关的脑区,但M1区是如何参与经典排尿行为相关的神经网络依然不明朗。为了明确M1第5层神经元调控膀胱活动的神经网络基础,我们在M1区第5层神经元分别注射AAV和VSV示踪病毒(顺行跨多级神经元),在脑桥排尿中枢(PMC)发现了被AAV标记的来自M1区的轴突和被VSV标记的神经元。该结果提示M1区第5层神经元与PMC区有直接的神经联系。故M1区很可能通过调节脑桥排尿中枢进而参与到经典的排尿环路中。