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乳腺是哺乳动物少数可以重复经历生长、功能分化和退化的器官之一,它是一种由皮肤汗腺衍生而来的外分泌腺,主要功能是泌乳。乳腺发育的情况决定着仔畜的生长发育状况及产奶量的高低。雌激素具有促进乳腺上皮细胞增殖、腺泡形成,乳腺导管延伸,泌乳发动与维持的作用,因此研究雌激素对山羊乳腺上皮细胞增殖及其表型维持的机制的具有重要意义。G蛋白偶联受体30(G-protein coupled receptor 30,GPR30)作为近年来新发现的雌激素膜受体,被激活后可介导快速非基因组效应来调控细胞的功能。实验室前期研究结果表明:雌激素在山羊乳腺上皮细胞增殖和上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)过程中发挥着重要的调控作用。而雌激素是否通过GPR30信号通路参与这些过程尚需进一步研究。因此本试验以关中奶山羊为试验材料,在山羊乳腺上皮细胞分离、纯化、鉴定的基础上,研究GPR30在山羊乳腺上皮细胞的表达与定位,并采用GPR30特异性激动剂G1及抑制剂G15研究雌激素/GPR30信号通路在山羊乳腺上皮细胞增殖及其上皮表型维持中的作用机制。研究内容和研究结果为:(1)采用无血清培养体系和组织块培养法,分离、纯化得到表达角蛋白18,不表达角蛋白14的上皮样细胞;进一步利用RT-PCR技术检测该细胞β-酪蛋白基因转录情况,结果表明在无血清培养体系中该细胞能够持续转录β-酪蛋白基因,进一步说明所分离得到的上皮样细胞为山羊乳腺上皮细胞。通过免疫荧光技术检测表明,在无血清培养体系中分离、纯化得到的山羊乳腺上皮细胞表达雌激素膜受体GPR30,且主要定位于细胞膜;进一步利用RT-PCR及蛋白质印迹技术检测GPR30 mRNA转录及蛋白表达情况,证明在无血清培养体系中山羊乳腺上皮细胞持续表达雌激素膜受体GPR30。(2)应用细胞计数,BrdU掺入等技术方法,研究雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞增殖能力的影响。结果表明,10-1000 nM的雌激素可以促进山羊乳腺上皮细胞的增殖,且呈剂量依赖效应;在含有雌激素或者雌激素膜受体GPR30激活剂G1的培养体系中,激活雌激素/GPR30信号通路,能够促进山羊乳腺上皮细胞的增殖,而无雌激素或者含有雌激素膜受体GPR30抑制剂G15的培养体系中,雌激素/GPR30信号通路未被激活,山羊乳腺上皮细胞增殖活动受明显抑制。说明,雌激素通过GPR30信号通路介导山羊乳腺上皮细胞的增殖。(3)采用免疫荧光、实时荧光定量PCR、蛋白印迹等技术,研究雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞EMT的影响。结果表明,在含有雌激素或雌激素膜受体GPR30激活剂G1的培养体系中,雌激素/GPR30信号通路被激活,能够维持山羊乳腺上皮细胞的上皮样形态特征,维持上皮细胞特异标记E-钙黏素(E-cadherin)mRNA与E-cadherin蛋白高表达,间质细胞特异标记N-钙黏素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)mRNA及蛋白低表达,EMT关键转录因子Snail2 mRNA低表达,说明雌激素或雌激素膜受体GPR30激活剂G1的添加抑制了山羊乳腺上皮细胞发生EMT。而在无雌激素或添加雌激素膜受体GPR30抑制剂G15的培养体系中,雌激素/GPR30信号通路被抑制,山羊乳腺上皮细胞失去上皮样细胞形态特征,表现出间质样细胞形态特征,其上皮细胞特异标记E-cadherin mRNA及其蛋白低表达,间质细胞特异标记N-cadherin和Vimentin mRNA及其蛋白高表达,与上皮间质转化相关的转录因子Snail2 mRNA高表达,说明无雌激素或添加雌激素膜受体GPR30抑制剂G15时,山羊乳腺上皮细胞会发生EMT。证明,雌激素/GPR30信号通路介导山羊乳腺上皮细胞上皮表型的维持,抑制EMT发生。(4)应用蛋白印迹技术检测雌激素/GPR30信号通路下游关键分子细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK 1/2)的表达情况。结果表明,雌激素可以快速激活ERK 1/2,其磷酸化水平在15 min内迅速升高,且持续至少4 h。雌激素可通过GPR30信号通路促进ERK 1/2快速磷酸化,ERK1/2参与了雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞增殖及上皮表型维持的过程。