第一部分:p GFP/h TERT/Neo转染正常人椎间盘髓核细胞构建稳定细胞目的:探讨h TERT(人端粒酶逆转录酶基因)重组绿色荧光表达载体的构建及其转染正常髓核细胞构建永生化细胞的可行性,为进一步探讨人椎间盘髓核细胞退变机制的实验研究提供标准细胞株。方法:通过目的基因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因真核表达质粒的构建、转染h TERT表达检测等步骤进行实验。XTT方法检测正常髓核细胞与转染h TERT髓核细胞生长曲线,RT-PCR检测两种细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖、BMP-2、IGF-1、TGF-β、BMP-4、COLLAGEN I、PDGF、FGF基因表达量,ELISA方法检测两种细胞外液Ⅱ型胶原、糖胺多糖表达量,无血清培养基状态下细胞周期分析检测细胞凋亡,裸小鼠种植实验检测永生化髓核细胞的致瘤性实验并进行病理分析。结果:转染hTERT后NP细胞增殖加速,传了20代细胞仍未见老化,细胞内Ⅱ型胶原、糖胺多糖基因表达与正常髓核细胞第1代类似,细胞外液Ⅱ型胶原、糖胺多糖与正常髓核细胞第1代类似。而未转染h TERT的NP细胞传4~5代增值基本停滞了。细胞免疫化学染色(免疫荧光):刚转染h TERT不久,髓核细胞外基质染色以Ⅱ型胶原为主,传20代之后,仍未见Ⅰ型胶原表达,而正常髓核细胞传4代以后Ⅰ型胶原取代了Ⅱ型胶原。细胞增殖:取第一代正常髓核细胞与第20代永生化髓核细胞行XTT检测,显示永生化髓核细胞从第4天开始,增殖速率明显高于正常髓核细胞。PG合成:取第一代正常髓核细胞与第20代永生化髓核细胞进行细胞外液PG合成检测,显示两者的PG合成并没有明显差异,正常髓核细胞为41.55±2.80μg/L,永生化髓核细胞为47.96±6.74μg/L。Ⅱ型胶原合成:取第一代正常髓核细胞与第20代永生化髓核细胞进行细胞外液Ⅱ型胶原合成检测,显示两者的Ⅱ型胶原合成并没有明显差异。正常髓核细胞为29.89±3.18μg/L,永生化髓核细胞为33.49±3.94μg/L。基因表达分析:取第一代正常髓核细胞与第20代永生化髓核细胞进行相关生长因子的检测,结果显示IGF-1、TGF-?基因在永生化髓核细胞中表达较正常髓核细胞上调了2-3倍。无血清诱导细胞凋亡实验。转染p GFP/h TERT/Neo(实验组,第20代)的髓核细胞24小时内未见明显凋亡或死亡。转染p GFP/Neo(对照组,第1代)的髓核细胞随着时间的推移,24小时内细胞凋亡或死亡明显增加。转染p GFP/h TERT/Neo(实验组,第20代)的髓核细胞与转染p GFP/Neo(对照组,第1代)的髓核细胞48小时凋亡率比较,对照组凋亡率明显增加。无血清诱导细胞凋亡实验中,转染p GFP/h TERT/Neo(实验组,第20代)的髓核细胞低凋亡率的原因为逃避了细胞周期的G1期捕获,细胞周期循环可以顺利进行。致瘤性试验:取第一代正常髓核细胞与第20代永生化髓核细胞分别种植于裸小鼠右肩胛背处。实验组:2周时,在裸小鼠右肩胛注射永生化髓核细胞处出现1.4×1.4cm2大小肿物,质硬、活动度可。3周后肿物明显减小,约1.0×1.0cm2大小,质硬。4周后,裸小鼠右肩胛背皮下肿物基本吸收,大约0.4×0.4cm2大小。对照组肉眼未见有肿物生成。第1、2、3、4周病理组织学研究表明:实验组裸小鼠右肩胛背皮下形成了细胞团块,中央有红色的坏死病灶,周围有中性粒细胞侵润,形成细胞包囊结构,可见较多纤维样母细胞,可见巨噬细胞,未见细胞异型性,无肿瘤生成。对照组为注射正常髓核细胞组,肉眼未见肿物形成,但取材切片后,仍见到细胞团块形成,炎症细胞侵润等,均未见细胞异型性。结论:本次实验表明运用h TERT转染髓核细胞可以成功构建稳定髓核细胞株,该细胞株具有与普通髓核细胞相似的生物学特性,具有良好的生物安全性,可以作为髓核细胞退变研究的标准细胞株,可以作为组织工程椎间盘的种子细胞。第二部分:micro RNA-155通过下调ERK1/2水平抑制椎间盘髓核细胞退变的实验研究目的:本研究通过基因芯片技术检测正常与退变髓核细胞中micro RNA的差异表达,通过检索micro RNA的靶基因,进行靶基因的验证,探讨其与MAPK信号通路的相互作用关系,为椎间盘髓核细胞退变的研究提供理论依据。方法:基因芯片技术按照常规操作步骤进行实验,通过数据库mi RDB,mi Randa,mi RBase,mi RWalk database Target Scan等来预测靶基因,并根据其靶基因是否包括ERK家族及micro RNA基因芯片差异倍数、信号强度来选择性研究micro RNA与ERK家族的关系。通过文献查阅以及生物信息学分析,选定两端信号大于8,相差倍数大于2,且其预测靶基因包括ERK家族成员的micro RNA进行研究。本次研究选定micro RNA-155为进一步研究的对象,其预测靶基因聚集信号通路为Neurotrophin signaling pathway,其中ERK家族包含在Neurotrophin signaling pathway当中。Micro RNA-155在正常髓核细胞中高表达,在退变髓核细胞中低表达。通过mimic RNA155及inhibitor RNA155对micro RNA 155进行过表达或沉默,RT-PCR、Western blot验证ERK1/2及其信号通路上游p MEK、MEK、p Raf、Raf、Ras、p Ras的表达情况。结果:与正常髓核细胞比较,退变髓核细胞micro RNA上调86个,下调77个。RT-PCR检测mico RNA-155的含量,与基因芯片预测结果相同,即在退变髓核细胞中降低,正常髓核细胞中升高。用has-mi R-155 mimics转染正常髓核细胞,micro RNA 155的基因表达量明显升高,成功过表达了micro RNA 155。用has-mi R-155 inhibitor转染正常髓核细胞,micro RNA 155的基因表达量明显降低,成功抑制了micro RNA 155。在正常髓核细胞中过表达mico RNA-155后,ERK1/2、p ERK1/2表达水平明显降低。抑制mico RNA-155后,ERK1/2、p ERK1/2表达水平明显增高。过表达或抑制mico RNA-155对髓核细胞m RNA ERK1/2表达水平无明显影响,表明mico RNA-155是在ERK1/2 m RNA转录后水平影响ERK1/2蛋白的表达。过表达或抑制micro RNA155,对kras、Raf1、p Raf1、MEK1/2、p MEK1/2蛋白表达无明显影响。过表达micro RNA155,髓核细胞II型胶原、糖氨多糖m RNA及细胞外基质蛋白表达量均明显升高。结论:mico RNA-155是在ERK1/2 m RNA转录后水平影响ERK1/2蛋白的表达,得出ERK1/2为mi R-155调控的新的靶蛋白,椎间盘退变过程中,下调的mi R-155通过上调ERK1/2的表达,增加基质金属蛋白酶,减少细胞外主要基质II型胶原及糖胺多糖的表达,参与了椎间盘退变。