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据估计,全球大约有3%的人口感染丙型肝炎病毒HCV。持续性的HCV感染是造成慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要原因,而这些疾病是世界各国面临的严重问题。HCV是一个有包膜的正链RNA病毒,基因组大约有9600个核苷酸,包括5’非翻译区、一个单独的开放阅读框和3’非翻译区。HCV的开放阅读框编码一个约3000个氨基酸的大的前体多聚蛋白。这个多聚蛋白能被病毒和宿主细胞蛋白酶切割产生至少10种蛋白：core、E1和E2等结构蛋白,以及p7、NS2、NS3、NS4A、 NS4B、NS5A和NS5B等非结构蛋白。程序性细胞死亡,又被称为细胞凋亡,能在多细胞生物中发生,与机体发育有关,也会导致多种复杂的病症。细胞凋亡对于控制和清除病毒感染有重要作用。细胞凋亡的典型特征包括：染色质浓缩、DNA片段化、细胞皱缩、形成凋亡小体和空泡等。其中,依赖caspase的凋亡信号途径主要分为两种：线粒体死亡途径和死亡受体途径。这两条途径都能激活caspase执行者caspase-3和caspase-7。线粒体死亡途径能被诸如DNA损伤等许多信号激活,导致线粒体外膜通透性增加,使得细胞色素C从线粒体膜间隙释放到细胞质中。释放到细胞质中的细胞色素C能与Apaf-1形成七聚体的凋亡体复合物,招募和激活procaspase-9。激活的caspase-9能切割和激活caspase-3,使得caspase-3能参与下游的死亡信号事件,如切割PARP。虽然目前还不清楚HCV病毒持续和病理进程的具体分子机制,但是有证据表明肝细胞凋亡在HCV致病机理中发挥重要作用。有报道显示,慢性HCV感染引起的肝损伤与细胞凋亡有关,并且HCV感染能通过线粒体死亡途径引起肝癌细胞凋亡。此外,有许多研究报道了HCV蛋白能诱导细胞凋亡,如core、E1、E2、NS3、 NS4A、NS5A和NS5B。但是,另有一些研究显示core、NS2、NS3、NS5A能抑制细胞凋亡。可能是因为这些HCV蛋白对诱导凋亡往往具有细胞选择性。HCV NS4B蛋白分子量约为27kD,是一个疏水性跨膜蛋白,含有至少四个跨膜结构域。NS4B能在细胞内形成膜网状结构,与其它HCV非结构蛋白形成复制复合物。NS4B不仅在HCV RNA复制中有重要功能,还能帮助病毒装配和释放。但是目前还没有有关NS4B与细胞生存之间关系的报道。在本研究中,我们在肝癌细胞系Huh7和非肝细胞系293T中表达HCV(JFH1)NS4B蛋白,发现能引起这两种细胞发生凋亡。DNA片段化实验结果表明,转染NS4B表达质粒24小时后就可以检测到细胞发生DNA ladder现象,尽管此时细胞内NS4B蛋白的表达水平还很低。细胞中转染具有GFP标签的NS4B质粒,用Hoechst33258染色后在荧光显微镜和激光共聚焦扫描电镜下观察发现,表达NS4B蛋白的细胞的细胞核形态发生改变,其细胞核固缩、碎裂,与典型的细胞凋亡现象相似。随后我们用蛋白免疫印记检测了细胞中的凋亡执行者caspase-3和caspase-7,以及它们的下游作用底物PARP,发现NS4B蛋白的表达能导致上述三种蛋白的切割或激活。有报道表明,当细胞中过量表达一种外源蛋白时,可能会引起内质网应激反应而导致细胞凋亡。为了确定NS4B蛋白引起的细胞凋亡是否由内质网应激反应引起,我们检查了细胞中与内质网应激反应相关基因的mRNA拼接和蛋白表达情况。结果表明,NS4B的表达并不会引起XBP1mRNA剪切,也没有导致BiP/GRP78和CHOP表达水平的上调。综上所述,HCV NS4B蛋白在细胞中表达早期就能引起细胞凋亡,表明细胞对NS4B蛋白诱导的凋亡是敏感的,并且与内质网应激反应无关。为了进一步深入研究NS4B蛋白诱导细胞凋亡的信号途径,我们对死亡受体途径和线粒体死亡途径中的关键蛋白进行检测,激活caspase-8能诱导死亡受体途径,而激活caspase-9能诱导线粒体死亡途径。结果表明,HCV NS4B表达能引起caspase-9的切割激活,但并不激活caspase-8。进一步研究发现,NS4B蛋白可导致细胞线粒体膜电位下降,使得线粒体膜间隙中的细胞色素C释放到细胞质中,从而确定,HCV NS4B诱导的细胞凋亡是由线粒体死亡途径引起的。综上所述,我们的研究表明,HCVNS4B能通过线粒体死亡途径诱导细胞凋亡,为研究HCV如何导致慢性感染和肝细胞癌提供新的思路。