H5N1亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)不仅可以感染禽类,而且可以跨越种属屏障感染人或其他哺乳动物,严重威胁人类健康。至今,H5N1禽流感病毒对人感染和致病的机制尚不完全清楚。空斑形成特性是禽流感病毒的重要表观特性之一,不同的H5N1病毒株空斑形成特性不同,同一人源H5N1病毒株在同种细胞上也可以形成大小和形态不同的空斑。来源于同一H5N1病毒株中的不同空斑类型病毒基因序列差异小;如果它们之间存在致病性差异,比较容易确定病毒致病性差异的分子基础。从H5N1禽流感病毒株空斑形成特性入手,从空斑形成特性具有不均一性的人源H5N1禽流感病毒株中挑斑纯化,得到空斑形成性状稳定的大斑病毒亚克隆株和小斑病毒亚克隆株,对比研究大、小斑病毒在基因序列、致病力和复制能力上的差异,从而揭示大、小斑病毒对小鼠致病性的差异机制及与病毒致病性相关的基因位点。一、不同来源H5N1禽流感病毒空斑形成特性的差异本研究首先建立了H5N1禽流感病毒空斑测定方法,对比研究人源H5N1禽流感病毒株和禽源H5N1禽流感病毒株在MDCK细胞上的空斑形成特性,发现这两种来源的H5N1病毒株形成的空斑存在显著差异:野生水禽来源的H5N1禽流感病毒A/GbhGull/QH/02/06和A/Bhgoose/QH/01/06在MDCK细胞上只能形成针尖状小斑,而且空斑形成时间较长;人源H5N1禽流感病毒A/Vietnam/1194/2004和A/Beijing/01/03在MDCK细胞上形成的空斑以大斑为主,夹杂小斑,大、小斑的直径相差数倍,空斑形成时间较短。表明H5N1禽流感病毒空斑形态的差异与病毒宿主来源相关,可能与病毒跨种属传播和进化有关。为进一步对比研究人源H5N1禽流感病毒株A/Vietnam/1194/2004中大、小斑病毒在致病性、复制能力等方面的差异,采用空斑分离纯化的方法,成功从人源H5N1禽流感病毒株A/Vietnam/1194/2004形成的混合斑中纯化、挑选出大斑亚克隆病毒和小斑亚克隆病毒,纯化的大、小斑病毒可稳定传代,空斑形成特性稳定。为下一步研究大、小斑病毒对动物致病性差异奠定了基础。二、人源H5N1禽流感病毒株中大、小斑病毒致病性差异及其机制为明确人源H5N1禽流感病毒株A/Vietnam/1194/2004中大、小斑病毒在致病性上是否存在差异,分别测定这两种空斑类型病毒对鸡和小鼠致病性。实验证明,大斑病毒和小斑病毒对鸡的静脉致病力指数IVPI分别2.98和2.99,证明两者对鸡都具有高致病性、彼此间致病力无明显差异。选择小鼠模型对比研究大、小斑病毒对哺乳动物致病性的差异,根据大、小斑病毒感染小鼠体重变化、平均生活日、死亡率、LD50等指标判断,小斑病毒对小鼠的致病性显著高于大斑病毒。对大、小斑病毒在哺乳动物细胞上的复制能力测定显示,大斑病毒的复制能力显著高于小斑病毒。结合人源H5N1禽流感病毒和禽源H5N1禽流感病毒空斑形成特性差异、大、小斑病毒对小鼠致病性差异分析,表明病毒空斑形成的大小与病毒复制能力相关,而病毒致病性差异可能与病毒复制能力差异无关。大斑病毒可能是禽流感病毒跨种属从禽类感染人类后从小斑病毒变异或进化而来。这些结果对H5N1禽流感病毒感染人类的致病机理和病毒进化规律研究都具有重要意义。研究显示,小斑病毒对小鼠中枢神经系统的亲嗜性显著高于大斑病毒:(1) A/Vietnam/ 1194/2004小斑病毒感染小鼠的脑中可以检测到病毒,但大斑病毒感染小鼠脑中不能检测到病毒;(2) A/Vietnam/1194/2004野生病毒株感染小鼠后,脑中分离到的病毒空斑测定显示均一的小斑;(3) A/Vietnam/1194/2004感染小鼠脑中分离的病毒对小鼠的致病性与体外MDCK细胞中空斑纯化的小斑病毒对小鼠致病性相同,都显著高于大斑病毒。以上结果说明,A/Vietnam/1194/2004小斑病毒对小鼠的中枢神经系统的具有很高的亲嗜性,而大斑病毒不能侵入小鼠中枢神经系统,小斑病毒对小鼠的强致病性与其能侵入小鼠中枢神经系统有关。进一步研究显示, A/Vietnam/1194/2004野生病毒株和小斑病毒滴鼻或静脉感染小鼠后,在血液和脑组织中都可以检测到病毒,两者存在平行关系;而大斑病毒经滴鼻或静脉注射感染小鼠后,在血液中可以检测到病毒,在脑中检测不到病毒。经血液感染小斑病毒和野生病毒株的小鼠比滴鼻感染的小鼠的死亡率高,平均存活天数短;而经血液感染或滴鼻感染大斑病毒的小鼠都没有死亡(肺内可以检测到病毒),说明感染途径对小斑病毒的致病性有显著影响,经血液感染比滴鼻感染对小鼠产生的病变更严重,但感染途径对大斑病毒的致病性无影响。以上结果提示,小斑病毒能经血液途径突破血-脑屏障侵染小鼠中枢神经系统。三、人源H5N1禽流感病毒株中大、小斑病毒空斑形成特性、致病性等差异的分子基础在确定大、小斑病毒在空斑形成特性、复制能力和致病性等表型上存在显著差异后,进一步对大、小斑病毒基因序列进行测定和对比分析,以明确大、小斑病毒在基因序列上是否也存在差异。序列分析结果显示,在大、小斑病毒的聚合酶蛋白(PB2、PB1及PA)、NP蛋白、膜蛋白HA和NA上存在21个氨基酸差异位点。根据这些蛋白的功能分析,大斑病毒的高复制能力可能与聚合酶蛋白上的多个差异位点有关,而其对小鼠的低致病性可能是由于NA上第2位(N to D)和315位(C to R)的变异导致了对小鼠中枢神经系统的亲嗜性降低或丧失,从而对小鼠致病性减弱。为进一步确定不同氨基酸位点与病毒致病性、复制能力等的关系,我们构建了A/Vietnam/1194/2004野生病毒株八基因片段与pHW2000的重组质粒,并在此基础上进一步构建了大、小斑病毒的PB2、PB1、PA、HA、NA和NP与pHW2000的重组质粒,为后续重组病毒拯救、病毒空斑形成特性、致病性差异的分子基础研究奠定了基础。上述研究结果,对揭示禽流感病毒跨种传播机制、遗传进化规律都具有重要意义。从H5N1禽流感病毒株空斑形成特性入手研究不同空斑类型病毒在基因序列、致病力和复制能力上的差异,为研究禽流感病毒致病机制和进化规律提供一种新的有效途径。