【摘 要】
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由病原菌引起的食源性疾病仍然是全球范围内公众健康和国家经济安全的重要威胁。因此,开发便捷、特异的检测方法对病原菌的检测至关重要。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S.typhimurium）是一种可以引起急性胃肠炎的食源性病原菌之一。它的传统细菌培养检测方法耗时长（约2～3 d）且操作复杂。因此,本研究基于电化学方法、等温核酸扩增技术以及CRISPR/Cas系统,建立了
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由病原菌引起的食源性疾病仍然是全球范围内公众健康和国家经济安全的重要威胁。因此,开发便捷、特异的检测方法对病原菌的检测至关重要。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S.typhimurium）是一种可以引起急性胃肠炎的食源性病原菌之一。它的传统细菌培养检测方法耗时长（约2～3 d）且操作复杂。因此,本研究基于电化学方法、等温核酸扩增技术以及CRISPR/Cas系统,建立了检测S.typhimurium的两种电化学生物传感器:1)基于CRISPR/Cas13a建立S.typhimurium-16S rRNA电化学生物传感器。修饰亚甲基蓝（MB）的DNA发夹结构探针P1固定在Au电极表面,发夹结构探针P1环部含有UU碱基。靶标菌S.typhimurium的16S rRNA特异性位点可以与Cas13a/crRNA复合物特异性结合,导致Cas13a酶活性被激活,高效切割发夹结构探针P1环部的UU碱基部位,从而使电化学活性分子MB被释放,电化学信号显著减弱,这就导致电化学工作站输出的电化学信号降低,从而达到了对靶标菌S.typhimurium的16S rRNA的定性及定量检测。通过对该电化学生物传感器检测条件的优化,实现了对S.typhimurium-16S rRNA特异性序列快速、灵敏且特异性的检测。该实验检测的线性范围为1 p M～10 n M,检测时间为60min,最低检出限为39 p M。2)基于杂交链式反应和CRISPR/Cas12a建立S.typhimurium电化学生物传感器。3’端修饰的电化学标签亚甲基蓝MB的发夹结构DNA（简称MB探针）的5’端通过与Au电极表面形成Au-S键而固定。磁珠（DBs）表面固定的接头探针（Linker）被S.typhimurium适配体锁定,适配体与靶标菌结合后从接头探针上脱落,暴露的单链接头探针给合HCR自组装形成DNA双链聚合物,DNA双链聚合物携带的多个单链支DNA与Cas12a/crRNA结合,从而激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性,切割电极表面MB探针并从Au电极表面释放,从而显著减少电子转导信号。致使电化学工作站的输出信号降低,从而达到对靶标菌S.typhimurium的检测。通过优化该生物传感器的检测条件,其检测时间确定为60 min,检测线性范围为10~4～10~8CFU/m L,最低检出限为20 CFU/m L。这些数据表明本研究建立了对S.typhimurium的两种快速、操作简便、可视化、灵敏且特异的新型检测方法。
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