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猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）是一种共价闭合的单股环状负链DNA病毒，是已知的最小动物病毒之一，为断奶后仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的重要病原，给全球养猪业带来严重的经济损失。目前，对PCV2的复制与致病机制没有一个全面的认识，研究发现，PCV2可在猪视网膜上皮（PD3）细胞中高效增殖且能产生明显的细胞病变（CytopathicEffect，CPE），因此，PD3细胞是作为研究PCV2致病机制的理想细胞模型。目前已知骆驼科动物体内天然存在一类缺失轻链和重链CH1区的新型抗体，又被称为重链抗体，而采用基因工程方法克隆的骆驼重链抗体可变区（variable domain of heavychain of heavy-chain antibody，VHH）是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段，分子量为15kDa，仅为常规抗体的1/10，其分子高度4nm，直径在2.5nm，故被称为纳米抗体（Nanobody，Nb）。由于纳米抗体较普通抗体具有一些独特的性质：分子量小易表达；高水溶性和稳定性；可识别独特的构象表位；高亲和力和高的组织穿透能力。因此纳米抗体在抗病毒、药物残留检测以及抗肿瘤治疗领域得到广泛关注。然而目前的研究主要集中在通过噬菌体表面展示技术构建纳米抗体文库获得某些靶标的纳米抗体，但该技术不适用于结构复杂、较难进行表达蛋白（如PCV2Cap蛋白）或位于胞内蛋白的纳米抗体筛选。本研究以PD3细胞为模型，研究PCV2与宿主细胞之间的相互作用，以及筛选PCV2Cap蛋白的纳米抗体。主要的研究内容如下：1．本研究基于Clontech公司推出的SMARTerTM技术，创建了一种构建VHH单链抗体免疫文库的新方法，构建的双峰驼VHH单链抗体免疫文库的转化效率和文库丰度分别为7.26×106cfu/3μg、1.97×109cfu/mL，重组率达到95%以上，符合酵母双杂交文库构建要求，该方法为纳米抗体的高通量筛选提供了新的技术平台。2．构建pGBKT7-Cap诱饵质粒，从双峰驼VHH单链抗体免疫文库中筛选获得21个Cap蛋白的纳米抗体，利用pCold DNAI系统对随机挑选的9个VHHs进行表达及纯化，在诱导温度为15℃、IPTG浓度为0.4mM和诱导时间为10h的条件下可溶性表达量最大。利用pMAL-c2X系统对Cap蛋白进行原核表达时，宿主菌选择大肠杆菌Rosetta、诱导温度选择37℃、IPTG浓度为0.3mM和诱导时间选择3h等表达条件下，Cap蛋白表达具有较好的可溶性。通过体外间接ELISA验证，这9个VHHs与阳性血清相比，有7个VHHs能很好的与PCV2和表达的Cap蛋白进行反应。且经免疫细胞化学和间接免疫荧光试验验证筛选的VHHs可以检测细胞内的PCV2抗原。3．利用PD3扩增PCV2的滴度可达10-6.4TCID50/mL，通过间接免疫荧光实验发现，PCV2在感染PD3细胞后36h，细胞荧光数最多且荧光最强，48h则出现了明显的细胞脱落等病变。用酵母双杂交技术构建猪视网膜上皮细胞cDNA文库，文库丰度为5.00×108cfu/mL、插入片段位于0.4-2.0kb、重组效率达到95%以上。以pGBKT7-Cap为诱饵，经过三轮筛选和酵母回转验证，最终获得6个宿主细胞因子，分别为C1QBP、CK2α、FASTK、Tubulin2A、ZNF622和GTFIIF。其中CK2α、FASTK、ZNF622和GTFIIF之前并未被报道过。而C1QBP在免疫反应过程中发挥重要功能。4．获得猪C1QBP的基因编码全长，为846bp，序列提交至GenBank（GenBank ID：KM068128）。免疫共沉淀和免疫荧光试验确证了Cap与C1QBP存在生物学上的相互作用，且Cap与C1QBP在细胞核周围的胞质区及质膜上存在共定位。此外通过qRT-PCR和Western blotting试验证实C1QBP在感染PCV2后的PD3细胞中表达上调（P＜0.05）。5．筛选出了对猪C1QBP基因具有干扰效果的shRNA序列，并构建了同时含有Puro和Neo双抗性的干扰慢病毒载体。包装得到的C1QBP干扰慢病毒滴度能够达到107cfu/mL。慢病毒感染PD3后，转导效率可到40%以上。通过qRT-PCR和Western blotting检测干扰效率，结果证实19bp的siRNA序列（GAGCACCAGGAGTACATTA）比21bp的siRNA序列（GCTTATATGACCACCTAATGG）干扰效果更好。6．敲低C1QBP可以使感染PCV2的PD3细胞出现CPE的时间提前，病毒滴度增加，而过表达C1QBP则降低了病毒滴度，这说明C1QBP对PCV2的增殖具有抑制作用。通过qRT-PCR和Western blotting试验比较了C1QBP在PK15和PD3细胞中的差异，结果发现PK15中C1QBP的含量显著高于PD3细胞（P＜0.05）。推测C1QBP可能是PCV2引起PD3细胞出现CPE的一个负调控因子。综上所述，本研究首次利用酵母双杂交技术构建猪视网膜上皮细胞cDNA文库和双峰驼纳米抗体免疫文库，成功获取与PCV2Cap蛋白相互作用的宿主蛋白及纳米抗体，为下一步揭示PCV2致PD3细胞病变的机理提供线索和技术手段。