论文部分内容阅读
第一部分人类CD4+CD25-CD45RA+初始T细胞和CD4+CD25-CD45RA-T细胞群体有不同的FOXP3表达模式目的研究CD4+CD25-CD45RA+初始T细胞和CD4+CD25-CD45RA-T细胞群体静息及激活状态下叉头框蛋白3(FOXP3)的表达,以探讨不同群体细胞的可能性质及同调节性T细胞的内在联系。方法采用磁珠分选人外周血淋巴细胞,使用CD4 T细胞磁选分离试剂盒、CD25磁珠及CD45RA磁珠分离CD4+T淋巴细胞、CD4+CD25+T淋巴细胞、CD4+CD25-CD45RA+T淋巴细胞及CD4+CD25-CD45RA-T淋巴细胞,采用流式细胞仪检测其纯度,并使用流式细胞仪检测其FOXP3的表达。然后使用CD3/CD28双信号分别激活CD4+CD25-CD45RA+T淋巴细胞及CD4+CD25-CD45RA-T淋巴细胞3天,流式细胞仪检测激活后的细胞FOXP3表达。结果静息状态下的CD4+CD25-CD45RA+初始T细胞不表达FOXP3,即使使用CD3／CD28双信号激活后也很少细胞表达FOXP3,而CD4+CD25-CD45RA-T细胞在静息状态下少量细胞表达FOXP3,但是一旦激活,则高比例的细胞表达FOXP3。结论不同亚型的T细胞具有不同的FOXP3表达模式,特别是在激活状态下有明显的区别。CD4+CD25-CD45RA+T细胞在未激活时不表达FOXP3, CD3/CD28双信号刺激3天仅很少量的细胞表达FOXP3,适合作为调节性T细胞体外诱导实验的靶细胞。第二部分激活的人类CD4+CD25-CD45RA-T淋巴细胞高表达FOXP3并有抑制功能的体外研究目的研究激活后的CD4+CD25-CD45RA-T细胞的表型特征及功能,以明确激活的CD4+CD25-CD45RA-T细胞是否有调节性T细胞的抑制功能及其抑制功能的变化。方法采用磁珠分选人外周血淋巴细胞,首先采用阴性分选分离CD4+T淋巴细胞,然后使用CD25磁珠去除CD4+CD25+T淋巴细胞,而CD4+CD25-T淋巴细胞再使用CD45RA磁珠分离部分CD4+CD25-CD45RA+T淋巴细胞,剩下的细胞作为CD4+CD25-CD45RA-T细胞分别采用各种方式进行激活,激活后的细胞使用流式细胞仪检测其FOXP3的表达,然后将其同自身CD4+CD25-CD45RA+T淋巴细胞共培养,使用溴标法检测其抑制自身CD4+CD25-CD45RA+T淋巴细胞增生的能力。结果不管是否有外源性的IL-2存在,使用CD3／CD28双信号激活的CD4+CD25-CD45 RA-T细胞都有高比例的细胞表达FOXP3,而且即使是CD3单信号激活,也有高比例的细胞表达FOXP3.中和IL-10及TGF-β并不能抑制其FOXP3的表达。进一步的功能试验表明,3天激活的CD4+CD25-CD45 RA- T细胞具有抑制功能。但是随着激活时间的延长,其抑制能力减弱,抑制能力的减弱可能同大量细胞的凋亡有关。结论人类外周血记忆性T细胞群体内存在一类调节性T细胞的前体细胞,这部分细胞在静息状态下不表达FOXP3,一旦接受TCR信号的激活,特别是有合适的共刺激信号存在的条件下,则快速表达FOXP3并且具有抑制功能,但激活后有快速凋亡的特征。第三部分人类上皮性卵巢癌细胞诱导激活的CD4+CD25-CD45RA+初始T细胞表达FOXP3并X-有抑制功能的体外研究目的研究上皮性卵巢癌细胞培养上清是否能够诱导激活的CD4+CD25-CD45RA+T初始细胞表达FOXP3并具有抑制功能及其内在机制。方法采用磁珠分选的方法分离高纯度的人类CD4+CD25-CD45RA+初始T细胞,使用CD3/CD28双信号激活的方法体外激活这些细胞并且在激活的同时在培养基中加入一定比例的上皮性卵巢癌细胞培养上清,共培养3天,激活后的细胞使用流式细胞仪检测其FOXP3的表达并使用溴标法细胞共培养试验观察其抑制功能。我们也在培养系统中分别加入几种细胞因子的特异性抗体,以观察其对FOXP3表达的影响。最后我们使用细胞因子模拟或者改变卵巢癌细胞培养上清中细胞因子构成的方法观察其对FOXP3表达的影响。结果我们使用了2个上皮性卵巢癌的细胞株及5个原代培养的上皮性卵巢癌细胞,同时使用一个正常的卵巢上皮细胞培养上清作为对照。发现所有的上皮性卵巢癌细胞培养上清均能诱导激活的CD4+CD25-CD45RA+T初始细胞表达FOXP3,而正常卵巢上皮细胞培养上清没有这个能力。随后的共培养抑制试验表明这些细胞具有抑制功能。细胞因子中和试验发现中和IL-10及TGF-β及IL-4均不能抑制激活的CD4+CD25-CD45RA+T初始细胞表达FOXP3,而LIF中和抗体部分抑制其FOXP3表达,但是LIF单独并不能诱导激活后的CD4+CD25-CD45RA+T初始细胞表达FOXP3。在培养系统中加入IL-6也不影响卵巢癌细胞上清诱导的FOXP3表达。结论人类上皮性卵巢癌细胞培养上清能够诱导激活的人类CD4+CD25-CD45RA+初始T细胞表达FOXP3,并具有抑制自身免疫细胞增殖的功能,提示人类上皮性卵巢癌细胞能体外诱导非调节性T细胞转化为调节性T细胞。改变培养上清中卵巢癌细胞分泌的单一细胞因子水平,不影响人类上皮性卵巢癌细胞诱导激活的人类CD4+CD25-CD45RA+初始T细胞表达FOXP3,提示可能多种细胞因子参与了FOXP3表达的诱导,而且细胞因子间可能存在复杂的相互作用。