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研究背景：先天性巨结肠症(Hirschsprungsdisease，简称HD)，又称肠无神经节细胞症，发病率为1/5000，在胃肠道先天性畸形疾病中占第二位，男女发病比例约4∶1。临床上表现为完全性或不完全性肠梗阻症状，严重影响小儿的生活质量，甚至危及生命。HD主要发病原因是肠壁肌间神经丛的神经节细胞缺失，以致受累肠段异常收缩，其近端结肠代偿性扩张肥厚，形成巨结肠。近年来，HD发病率有所上升，引起国内外学者的重视。HD是一种病因复杂的疾病，虽然HD的病理学基础为病变肠段神经元细胞缺失，但神经元细胞缺失的原因至今仍有争议。所以进一步明确HD的发病机理，降低HD的发病率，并探索有效的非创伤性治疗方法，成为目前最为关注的问题。
HD的发病与多种因素有关，包括基因遗传因素和微环境的影响。其中，基因遗传因素被认为是影响其发病的主要原因，HD属于典型的多基因遗传病。目前，已经有十余种基因和4个区域被证实与HD的发病有关，如RET、EDNRB、EDN3、GDNF、SOX10、ECE-1、Neurturin、9q31等。
近年来，RET基因已经被证实是HD的主要致病基因。RET基因编码一种酪氨酸激酶受体，该受体为跨膜蛋白聚合体，有1114个氨基酸残基构成，其主要功能是转导细胞生长和分化信号，在细胞外环境和细胞核之间起连接作用。据国外资料统计，家族性HD约40-50％存在RET基因突变，散发性为15-20％。
至今，国外的研究已发现90多种RET基因突变类型，散发于20个外显子中，突变方式除个别为大片段缺失外，多数为点突变。近年来，还发现RET基因上的一些特殊单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位点与HD具有紧密的关联，如外显子2上的A45A，外显子13上的L769L。2005年，Chakravarti等通过对126个HD家系的研究，发现RET基因内含子1中6个SNPs与HD密切相关，特别是RET+3位点。该位点位于多种属保守序列MCS+9.7内，具有重要意义。迄今为止，国内对HD患者RET基因突变的研究已有报道，但对RET基因上多态性位点与HD关联性的研究尚未见报道。
EDNRB基因位于13q22，长约24kb，含7个外显子和6个内含子，其编码的蛋白为G蛋白偶联的跨膜受体，包括七个跨膜区。EDNRB及其配体介导的信号通路对肠神经节细胞的发育具有重要的作用。已有实验证实，EDNRB基因缺失可以使实验鼠产生巨结肠，并且该动物模型比RET基因缺失产生的HD模型，更接近于人类的HD表型。而位于20号染色体的EDN3基因则编码EDNRB蛋白最为重要的配体EDN3，如EDN3基因编码区发生突变，引起蛋白功能改变或者蛋白前体不能水解为功能性蛋白，则同样会对EDNRB/EDN3信号通路产生影响，引起HD的发生。至今，国外研究已经发现17种EDNRB基因突变型，突变率5-10％，而EDN3基因突变型更为少见，约6种。至今，对中国人HDEDNRB与EDN3基因的突变研究尚少。
研究目的：(1)研究中国人散发性HDEDNRB、EDN3基因突变类型、突变方式和突变率等特征，探讨HD的发病机理，揭示中国人散发性HD与EDNRB、EDN3基因突变的关系。(2)研究中国人散发性HD与RET基因上SNP位点RET+3、rs2506004、rs2506005的关联性，揭示SNP位点在中国人散发性HD发病中所起的重要作用，并寻找与HD相关的单倍体型。
研究方法：收集临床确诊的散发性HD患儿和正常对照儿童外周血，盐析法提取基因组DNA，应用聚合酶链反应—单链构象多态性分析(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism，PCR-SSCP)技术，对EDNRB基因全部七个外显子以及EDN3基因两个外显子进行突变筛查，并对发现异常泳动带的样本进行DNA测序，以明确突变类型；应用PCR-直接测序技术，对收集到的病例与正常对照样本进行RET+3、rs2506004和rs2506005位点的基因型分析，统计等位基因频率，再运用SHEsis软件(http：//202.120.7.14/analysis/myAnalysis.php)进行等位基因频率、位点连锁不平衡以及单倍体频率分析。
研究结果：在75例散发性HD中应用PCR-SSCP分析EDNRB及EDN3基因，发现8例样本具有异常泳动条带。经测序证实，6例患者携带L831L的同义突变，此突变已经被确认为单核苷酸多态性位点，人群基因频率为0.5；2例患者携带V553M的错义突变，此突变位于蛋白的跨膜区域，国外人群研究结果中未见报道，可能是中国人所特有，突变频率为2/75(2.8％)。EDN3基因上未有突变被发现。
对132例正常样本和99例散发性HD患者进行RET+3位点的基因分型，结果发现正常人群以TC基因型为主，T等位基因频率为45％，C等位基因频率为55％；病例样本以TT基因型为主，T等位基因频率为72％，C等位基因频率为28％。Rs2506005位点在正常人群中以CT基因型为主，C等位基因频率为45％，T等位基因频率为55％；病例样本CC基因型为主，C等位基因频率为72％，T等位基因频率为28％。Rs2506004位点在正常人群中以AC基因型为主，A等位基因频率为45％，C等位基因频率为55％；病例样本以AA基因型为主，A等位基因频率为72％，C等位基因频率28％。这三个位点完全连锁不平衡，构成TCC，CTA两种单倍体型。后者与HD相关(FishersExactP=1.81×10-8，＜＜0.0001)，男性人群增加5.1倍的发病风险，女性人群增加2.1倍的发病风险。
研究结论：(1)EDNRB基因是HD的重要易感基因，突变率小于5％。EDN3基因突变在中国人散发性HD中罕见。(2)RET基因上RET+3、rs2506004、rs2506005位点构成的CTA单倍体与HD的发病密切关联，对男性发病风险的影响远大于女性，具有性别差异。结果提示HD易感基因上的一些特殊SNPS可单个或互相连锁提高HD的发病风险，产生高危人群。