苋菜（Amaranthus tricolor L.）是石竹目苋科苋属的一年生草本植物,其茎和叶都含有大量的甜菜色素,具有较高的营养价值和药用价值。甜菜色素主要分布在部分石竹目（Caryophyllales）植物中,不能与花青素共存。甜菜色素合成不仅与物种的内在因素有关,还容易受到温度、光照和外源激素等的影响。Mi R156及其靶基因参与调节植物营养和生殖生长的转变、花的发育和次生代谢产物的合成,但是否参与甜菜色素合成还不清楚。因此,本研究以苋菜为材料,从苋菜miRNA数据库中筛选出miR156家族成员成熟体,并克隆了前体序列;从苋菜转录组数据库中筛选出SPLs家族成员,并克隆得到miR156靶基因AmSPL9的cDNA全长序列;研究了不同处理条件、红色和绿色苋菜品种及苋菜不同组织部位中miR156及靶基因SPLs的表达情况,以期为深入研究miR156-SPL对甜菜色素代谢机制的调控机制奠定基础。主要研究结果如下:1苋菜miR156家族成员筛选及前体克隆从苋菜miRNA数据库中筛选得到了12条miR156家族成员成熟体序列,然后采用PCR技术克隆出miR156家族成员前体序列,测序结果显示pre-miR156片段大小介于70～286 bp之间,形成二级结构的最小折叠自由能（d G）介于-15.7～-76.5 kcal/mol之间,平均为-45.3 kcal/mol,miR156家族成员的前体序列中均能找到成熟序列。进化树表明苋菜Am-miR156k和拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）At-miR156i;At-miR156j、Am-miR156a-2和Am-miR156f进化过程相近。2苋菜SPL家族基因成员鉴定及生物信息学分析基于‘全红’苋菜转录组数据库筛选获得17个SPL家族成员,并进行生物信息学分析预测。结果表明,17个AmSPL蛋白分别由186～777个氨基酸组成,相对分子量从20.53～88.27ku。构建AmSPL与拟南芥16个At SPL成员系统进化树,并根据At SPLs基因家族的分类标准将AmSPL成员分为6组。预测分析其中的8个AmSPL可能是miR156的靶基因。实时荧光定量PCR分析表明,在黑暗条件下,AmSPLs的表达量均高于蓝光下,说明AmSPLs的表达受到蓝光负调控。3苋菜miR156靶基因SPL克隆及裂解位点的验证采用RT-PCR结合RACE技术从‘全红’苋菜中克隆出SPL9基因cDNA全长序列,命名为AmSPL9,其开放阅读框为1131bp,编码376个氨基酸。密码子偏好性分析表明:AmSPL9基因的密码子选择偏好性较弱,表明该基因的表达水平可能相对较低,偏好使用以A/T碱基结尾的密码子。CUC是编码苋菜AmSPL9蛋白质中亮氨酸的偏好密码子,CAU不参与苋菜AmSPL9基因的编码。系统进化树分析表明,苋菜与拟南芥亲缘关系较近。酵母菌更适合做苋菜AmSPL9基因的真核表达载体,甜菜是苋菜AmSPL9基因最理想的遗传转化受体。使用改良RLM-RACE法以miR156a-5p为参照,对靶基因AmSPL2、AmSPL6、AmSPL9和AmSPL16进行裂解位点验证,发现裂解位点有所不同,但最终都成功验证转录片段,其中miR156a-5p对AmSPL2/6/16裂解位点位于结合区域的AG处裂解,而AmSPL9的裂解位点位于结合位点13bp GA处切割靶标m RNA。4苋菜miR156及其靶基因在不同处理下的表达分析将苋菜在无菌条件下不同温度培养1周后作为试验材料进行qPCR分析发现,miR156a-5p、miR156b和miR156k-2对温度的响应各不相同,低温15℃条件下miR156a-5p和miR156k-2表达量达到较高水平,miR156b则在20℃条件下达到较高水平,同时miR156k-2在20℃条件下表达量达到最低,说明同一家族不同成员对温度的响应也不相同。AmSPL6、AmSPL9和AmSPL16在30℃表达量达到最低,并且不同温度下苋菜的AmSPL基因的表达量差异明显。在不同温度条件下miR156a-5p和miR156k-2与靶基因AmSPL2之间存在负调控模式。将苋菜种子在不同浓度GA3的无菌条件下培养一周,qPCR分析发现,低浓度的外源GA3可以抑制miR156的表达,但家族成员之间的表达存在差异,趋势不完全一致。与CK相比,外源GA3也抑制了AmSPL的表达。通过注射法将人工合成模拟物miR156注射苋菜叶片,发现过表达miR156注射叶片中miR156a-5p、miR156b和miR156k-2的表达量极显著高于其他处理,AmSPL9表达量极显著低于其他处理,表明注射法可以完成苋菜的瞬时表达,并且miR156-AmSPL负相关调控机制在苋菜中依然存在。以上说明温度、外源GA3等外界环境都可能调控苋菜miR156及靶基因AmSPL的表达来调控苋菜生长发育及次生代谢产物的合成。5苋菜miR156及SPL基因在红色和绿色苋菜叶片及不同部位表达分析选取红色和绿色两种苋菜作为材料,qPCR分析发现,miR156a-5p、miR156b和miR156k-2在红色叶片中的相对表达量较高,而AmSPL2、AmSPL6、AmSPL9和AmSPL16基因在红色叶片中表达量受到了抑制,说明miR156与AmSPL表达量负相关,miR156-AmSPL模式可能会影响苋菜叶片中甜菜色素的合成。取‘全红’苋菜的不同组织部位进行研究,qPCR结果显示,不同部位中miR156和AmSPL之间存在很大差异,miR156a-5p在红色叶脉中的表达量达到最高,在去表皮茎中最低,AmSPL2和AmSPL9在去表皮茎中最高,AmSPL6和AmSPL16在茎表皮处表达量最高,说明miR156及其靶基因AmSPL可能参与苋菜器官形成及次生代谢产物的合成。