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本文围绕杆状病毒泛素(ubiquitin,ubi)基因启动子结构及功能元件、杆状病毒IE1及hr3对晚期ubi和极晚期polh启动子的作用、参与杆状病毒晚期基因泛素表达的病毒因子、耐高温β-glucosidase在家蚕中的表达及纯化等方面作了一定的研究。 (1)杆状病毒ubiquitin基因启动子结构及功能元件的分析 克隆的启动子与BmNPV T3株及AcMNPV C6株ubi启动子的同源性分别为98.9%、99.5%,二者之间的同源性为92.8%。该序列中具有两个杆状病毒晚期基因转录起始位点TAAG和两个TATA box,三个CAAT。Northern blot证明杆状病毒ubi为晚期表达基因,在病毒感染后约12h或更早开始大量表达,并具有多个转录本。 ubi启动子区域缺失分析证明Acubi启动子对病毒因子的主要响应区在ATG上游-595～-382bp;而Bmubi启动子中则主要位于ATG上游-382～-124bp;在ATG上游-383～-187 bp的196 bp启动子片段,含有一个TAAG、CAAT基序和TATA box,也具有启动子的活性。 对ubi启动子进行突变分析发现,TATA box和TAAG突变后均能下调该启动子的活性,而CAAT突变却可以上调启动子的转录活性大约3至4倍左右。 (2)杆状病毒IE-1及hr3对晚期ubi和极晚期polh启动子的作用 在病毒感染的情况下,顺式连接或反式作用的hr3可分别上调ubi启动子活性达62和1.4倍左右;与ie-1共转染时,顺式连接的hr3可上调ubi启动子转录约210;反式作用则为9倍。ubi启动子序列中与ie-1响应的区段主要位于ATG上游-595～-382 bp之间。 对于极晚期polh启动子,在BmNPV感染的细胞中,顺式连接的hr3可增强报告基因表达283倍,反式作用为1.8倍左右;报告质粒与ie-1共转染时,顺式或反式的hr3可分别增强polh启动子控制的报告基因表达621倍和4.2倍。 用报告质粒转染家蚕5龄第二天的幼虫,hr3同样可显著提高ubi和polh启动子的转录活性。 (3)参与杆状病毒晚期基因ubi表达的病毒因子研究 通过构建BmNPV基因组文库,对参与ubi基因转录的病毒因子进行了筛选。单独的立即早期基因ie0、ie2、pe38等对ubi基因启动子没有激活作用,ie-1能反式激活ubi基因启动子的转录,但报告基因的表达量较低。在ie-1存在时,he65、lef-11、lef-6、p35及gp118-gp119,gp104-gp107片段均能启动ubi启动子的转录。 (4)耐高温β-glucosidase在家蚕中的表达及纯化 获得了能够表达β-glucosidase的重组病毒。酶活性为10 199.5 U/毫升血淋巴,19 797.4 U/头蚕。酶的最适反应温度为105 ℃,最适反应pH为5.0,在90-110℃保温10 min,酶活性没有大的影响,当温度升高到140℃时,酶活才会急剧下降;二价离子及高盐对表达的β-glucosidase活性均没有显著影响。初步纯化的上清酶液中含有约80%以上的重组蛋白。耐高温β-glucosidase在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达,为该酶的大规模生产及应用奠定了坚实的基础。