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目的:三磷酸腺苷结合盒转运体A(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)在细胞内胆固醇流出中具有重要的作用。载脂蛋白A-1模拟肽D4-F是含有18氨基酸残基的小分子肽,其-两性螺旋基序是与脂质结合重要的结构基础。目前,动物实验证明,D4-F具有抗炎抗动脉粥样硬化的作用,在D4-F喂养的小鼠血液中,其三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇水平较正常组降低。在细胞试验中发现D4-F能够上调ABCA1蛋白质水平,但其具体的机制不清楚。Cdc42是RhoGTP酶超家族成员,分子量为25KD。有研究表明Cdc42参与细胞内胆固醇的流出。丹吉尔病患者的成纤维细胞和巨噬细胞中Cdc42表达下调。apoA-1与ABCA1结合后,能够活化Cdc42。而本实验组研究已经证实apoA-1通过cAMP/PKA信号途径影响ABCA1蛋白质的表达及其介导的胆固醇的流出。基于这些研究,我们以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为模型,探讨D4-F对ABCA1表达及其介导的胆固醇的影响,并进一步观察Cdc42/cAMP/PKA是否在这个过程中起作用。第一部分D4-F对ABCA1表达及其介导的胆固醇流出的影响目的: D4-F作为apoA-1的模拟肽,它是否影响THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中ABCA1表达及其介导的胆固醇流出?故本实验的目的是观察D4-F对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中ABCA1表达及其介导的胆固醇流出的影响。方法: THP-1单核细胞经PMA诱导贴壁后,加入oxLDL诱导其转化为泡沫细胞后,1.不同浓度(0μg/ml﹑2μg/ml﹑4μg/ml﹑6μg/ml)D4-F处理细胞24小时; 2. 6μg/ml D4-F处理细胞不同时间(0﹑6﹑12﹑24小时)和5μg/ml BSA处理细胞24小时;3. 6μg/ml D4-F与20μg/ml D4-F放线菌酮共处理细胞0,1,2小时。实时定量PCR和Western印迹分析法分别检测ABCA1 mRNA与蛋白质的表达;液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出,高效液相色谱分析细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量。结果: D4-F不影响ABCA1m RNA水平; 6μg/ml D4-F和D4-F处理细胞24小时, ABCA1蛋白质的表达至高峰;加入放线菌酮抑制蛋白质合成之后,D4-F能够明显减缓ABCA1蛋白质的降解;高效液相色谱法显示D4-F降低了细胞内总胆固醇,游离胆固醇和胆固醇酯的含量。液体闪烁法检测D4-F能够浓度依赖性和时间依赖性提高细胞内胆固醇及其磷脂的流出。第二部分D4-F增加ABCA1表达及其介导胆固醇流出的机制探讨目的:前期实验结果显示D4-F增加ABCA1蛋白质表达及其介导的胆固醇流出,故本实验主要探讨D4-F影响ABCA1蛋白质表达及其介导胆固醇流出的可能机制。方法: THP-1单核细胞经PMA诱导贴壁后,加入oxLDL诱导其转化为泡沫细胞,1. 6μg/ml D4-F处理细胞0,15,20,25分钟后,观察PKA活性;2.转染PKA-siRNA后,6μg/ml D4-F孵育24小时;3. 1.0mM PKA特异性激动剂dBcAMP与6μg/ml D4-F孵育24小时;4. 20μg/ml D4-F放线菌酮与PKA-siRNA干扰或dBcAMP和6μg/ml D4-F处理细胞0,1,2小时;5. 6μg/ml和100μg/l腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536或25mM Cdc42抑制剂Scramine B在37℃孵育30分钟;6. 6μg/ml D4-F处理细胞0,10,15,20分钟后,观察Cdc42活性。吸光度值检测PKA活性和Cdc42活性检测试剂盒检测Cdc42活性;液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出;Western印迹分析法检测ABCA1蛋白质的表达和ABCA1磷酸化;酶联免疫试剂盒检测cAMP水平。结果: D4-F激活PKA;PKA-siRNA能下调PKA蛋白质的表达,与对照组比较表达下调达85%;PKA-siRNA和dBcAMP均不影响D4-F增加ABCA1蛋白质的作用;PKA-siRNA,dBcAMP,SQ22536均能逆转D4-F引起的ABCA1介导的胆固醇流出增加;同时,SQ22536能逆转D4-F引起的cAMP水平,PKA活性及ABCA1磷酸化的增加;D4-F能影响Cdc42活性;Scramine B影响了D4-F引起的cAMP水平和PKA活性增加。结论:1 D4-F呈时间和浓度依赖上调ABCA1蛋白质表达;2 D4-F可以通过Cdc42/cAMP/PKA途径增加ABCA1丝氨酸磷酸化和ABCA1介导的胆固醇流出。