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酚类化合物是水体中常见的有机污染物,对人类、水生生物和农作物危害很大。其中甲酚是含酚废水中含量最高的化合物之一,而硝基和溴原子等取代基的存在,往往对生物体具有更大的危害,并且在环境中的降解半衰期增长。目前,处理大量、低浓度含酚废水的首选方法是生物法,即利用微生物体内的代谢过程将其完全降解。然而,酚类化合物代谢过程中的某些中间产物,如儿茶酚类物质和粘糠酸半醛类物质等具有很高的经济价值。针对上述问题,本论文对苯酚羟化酶基因工程菌(PH_IND)和2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因工程菌(BphCLA-4)多级转化对甲酚、对硝基酚和对溴代酚进行了研究。结合分子对接技术、电荷分布分析和LC-MS技术确定了PH_IND-BphCLA-4多级转化对位取代酚的机理。分子对接结果表明,3种对位取代酚作为苯酚羟化酶的底物,3种对位取代儿茶酚作为2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶的底物,各底物分子均能到达酶的活性中心,与之较好地结合并发生反应。由底物分子通过自然键轨道理论优化后的电荷分布可知,羟基连接的碳原子处电势最高,羟基邻位碳原子的电势最低,表明对位取代酚的羟基邻位、对位取代儿茶酚的双羟基间位最容易发生反应。液质联用分析的产物质谱棒状图分别与对位取代儿茶酚和含相应取代基的粘糠酸半醛一致。最终,推测PH_IND-BphCLA-4多级转化对位取代酚的机理为：苯酚羟化酶在对位取代酚的羟基邻位加羟形成相应的对位取代儿茶酚；2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶在对位取代儿茶酚的双羟基间位加氧开环断裂,转化为含相应取代基的粘糠酸半醛。对菌株浓度和底物浓度这两个多级转化的反应条件进行了优化,实验结果为：最佳菌体浓度为OD600=2.5,转化底物的最佳浓度分别为1mmol/L的对甲酚、0.5mmol/L的对硝基酚、0.25mmol/L的对溴代酚。在优化条件下PH_IND转化对位取代酚、BphCLA-4转化对位取代儿茶酚分别在反应60min和10min后便反应完全,具有较强的转化能力。对多级转化进行了PH_IND和BphCLA-4全细胞的动力学分析。PH_IND转化对甲酚的最大反应速率(Kmax=0.31μM/min/mg干菌)最大,分别是对硝基酚和对溴代酚的1.4倍和2.4倍。PH_IND与底物的亲和力大小顺序为：对溴代酚>对硝基酚>对甲酚。BphCLA-4转化对硝基儿茶酚的Vmax=1.01μM/min/mg干菌,分别是对溴代儿茶酚和对甲基儿茶酚的1.6倍和2.1倍。BphCLA-4与底物的亲和力大小顺序为：对甲基儿茶酚>对溴代儿茶酚>对硝基儿茶酚。