论文部分内容阅读
研究背景与目的:肝纤维化是肝脏对不同病因所致的慢性损害产生的创伤愈合反应,表现为肝脏细胞外基质各种成分的过度沉积及分布异常,是纤维增生和纤维降解不平衡的结果,是多种慢性肝病向肝硬化发展的中间病理阶段,目前的研究认为肝纤维化病变经过适当的积极治疗有希望延缓甚至逆转,而发展到肝硬化阶段则很难逆转。中医药治疗肝纤维化具有多靶点、多环节、多途径复合作用的特点,针对肝纤维化发病的复杂机制,体现了中医药的传统优势。蕲艾是湖北省的道地药材,临床研究发现蕲艾有明显的抗肝纤维化的作用,本课题通过建立免疫性肝纤维化动物模型,初步了解蕲艾提取液抑制大鼠肝纤维化的作用,并通过其对大鼠肝组织中TGFβ-Smad信号转导通路中关键的信号传导分子TGFβ1、Smad 3、Smad 4、Smad 7表达水平的变化,以及对抗凋亡基因Bcl-2和细胞周期蛋白的影响,探讨蕲艾提取液抗肝纤维化的分子机理。方法:1.采用猪血清诱导肝纤维化模型,将72只Wistar大鼠适应喂养1周后,随机分为正常对照组、肝纤维化模型组、蕲艾提取液低剂量、中剂量和高剂量组及丹参治疗组,每组12只。除正常对照组外,其余各组腹腔注射无菌猪血清0.3ml,每周2次,共10周。蕲艾提取液高、中和低剂量治疗组分别给予6ml/只、3ml/只和1.5ml/只的蕲艾提取液灌胃,每日1次;丹参治疗组给予丹参注射液6ml/只灌胃,每日1次;模型组给予生理盐水6ml/只灌胃,每日1次;正常对照组大鼠按100g体重给予生理盐水0.3ml腹腔注射,每周2次,共10周,并给予生理盐水6ml/只灌胃,每日1次。于10周末最后一次注射猪血清后48h,断头处死各组动物,眼球取血留取足够的血,分离血清,并取一部分肝脏组织,4%福尔马林固定,常规石蜡包埋切片。一部分新鲜肝组织梯度置于-70℃保存,用于实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法及蛋白印迹实验(Western blot)。2.血清学检测:各组实验大鼠血清分别检测肝纤维化血清学指标透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型前胶原(IV-C)的含量,以及脂质过氧化指标超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)O ELISA法检测血清中TGFβ1含量。3.肝组织学检测:采用HE染色和Masson三重胶原染色法观察大鼠肝组织病理学变化。4.免疫组织化学检测:采用免疫组化SABC法,结合显微镜,观察大鼠肝组织TGFβ1、Smad3、Smad4、Smad7以及Bcl-2、Cyclin D1的表达变化。5.采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法及蛋白印迹实验(Western blot)分别检测TGFβ1、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA和蛋白及Bcl-2、cyclinDl mRNA和蛋白的表达变化。结果1.蕲艾提取液抑制大鼠肝纤维化作用的实验研究与正常对照组比较,模型组中肝纤维化血清学指标HA、PCⅢ、LN、IV-C含量均明显升高(P<0.01),血清TGF-β1水平亦明显升高(P<0.05),血清MDA含量上升、SOD活性显著降低(P<0.01);与模型组比较,蕲艾提取液治疗各组HA、PCⅢ、LN、IV-C含量均显著降低(P<0.05),血清TGF-β1含量亦明显下降(P<0.05),血清脂质过氧化指标MDA含量显著降低(P<0.05), SOD活性显著升高(P<0.05),且蕲艾提取液治疗组与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。光镜下观察:模型组大鼠可见肝组织结构部分破坏,肝细胞发生广泛的变性水肿,水样变性甚至气球样变性,还可见程度、范围不等的肝细胞坏死;肝板排列紊乱,部分肝小叶失去正常结构;汇管区纤维隔内有大量嗜酸性细胞、单核淋巴细胞及成纤维细胞浸润,大量胶原沉积,有较明显纤维组织增生,胶原纤维沿汇管区及中央静脉周围向肝小叶内延伸,可见相互连接的纤维分割肝小叶,甚至有部分区域有早期肝硬化表现。蕲艾提取液及丹参治疗各组大鼠肝脏在色泽、质地、大小、表面光滑度方面较模型组有明显改善,细胞变性和坏死程度显著减轻,肝小叶结构破坏不明显,炎性细胞浸润和纤维组织增生减少,中央静脉和汇管区有少量纤维组织延伸,不同剂量蕲艾提取液治疗组间无显著性差异。2.蕲艾提取液对大鼠肝组织中TGFβ-Smad信号转导通路蛋白表达的影响免疫组织化学结果显示,TGFβ1、Smad3、Smad4在正常对照组肝细胞内无阳性细胞表达,模型组肝内表达明显增强,主要见于间质细胞、炎性细胞、损伤的肝细胞,阳性物质主要集中在细胞膜上,胞质内有少量表达;蕲艾提取液各剂量组及丹参组阳性细胞数目明显减少,阳性染色程度明显减轻。RT-PCR及Western blot检测结果显示,TGFβ1、Smad3、Smad4 mRNA及其蛋白,在正常对照组中表达明显低下,而Smad7 mRNA及其蛋白表达则明显升高;蕲艾提取液高、中、低剂量组TGFβ1、Smad 3、Smad4 mRNA及其蛋白与模型组比较表达逐渐减少,Smad7 mRNA及其蛋白表达与模型组比较则逐渐升高,其中中、高剂量组TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA及其蛋白与模型组比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01),而与丹参组比较无显著性差异(P>0.05)。3.蕲艾提取液对抗凋亡基因Bcl-2及细胞周期蛋白Cyclin D1表达的影响免疫组织化学结果显示,Bcl-2及Cyclin D1蛋白在正常对照组肝细胞内无阳性细胞表达,模型组肝内表达明显增强,主要见汇管区、肝细胞、间质细胞膜上及细胞浆内,阳性物质主要集中在细胞膜上;蕲艾提取液各剂量组及丹参组阳性细胞数目明显减少,阳性染色程度明显减轻。RT-PCR及Western blot检测结果显示,正常对照组Bcl-2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达较模型组低下,蕲艾提取液各剂量组Bcl-2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达较模型组逐渐减少,其中高剂量组与模型组比较有显著性差异(P<0.05),与正常对照组和丹参组比较无显著性差异(P>0.05)。结论1.蕲艾提取液可以明显改善猪血清诱导的大鼠免疫性肝纤维化的肝组织病理学损害,减轻纤维组织增生,明显减少胶原纤维间隔、肝细胞坏死、变性以及炎性细胞的浸润,并能有效降低肝纤维化血清学指标,其抗纤维化的机理可能与抗脂质过氧化有关。2.蕲艾提取液能够显著抑制大鼠肝组织中TGFβ1、Smad3、Smad4 mRNA及其蛋白表达水平,上调Smad7 mRNA及其蛋白表达水平,表明其可能通过有效调控TGFβ1-Smad信号转导通路,从而抑制大鼠肝纤维化。3.蕲艾提取液能够降低大鼠肝组织中抗凋亡基因Bcl-2 mRNA及其蛋白表达水平,提示其可能通过有效诱导大鼠HSC凋亡,从而达到抗肝纤维化的作用。4.蕲艾提取液可能通过下调大鼠肝组织中细胞周期蛋白Cyclin D1 mRNA及其蛋白表达水平,发挥对细胞周期的调控,抑制细胞增殖,而达到抗肝肝纤维化的作用。