目的：　　 尽管肿瘤的治疗策略在不断改进，传统的肿瘤治疗方法，如外科切除、放射治疗和化学药物治疗并不能完全地治愈肿瘤。随着生物学技术的发展，基因技术开始应用于肿瘤治疗，其中对自杀基因疗法应用的研究较为广泛。自杀基因又称药物敏感基因(drug sensitivity gene)，它可以在体内将无毒性的前体药物转化为有毒性药物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。由于这种方法常以病毒作为载体进行基因转导，故称为病毒介导的酶解药物前体治疗(VDEPT)。　　 与哺乳动物的四种脱氧核苷酸激酶不同的是，黑腹果蝇只有一种脱氧核苷酸激酶，Dm-dNK(deoxyribonucleoside kinase of Drosophila melanogaster)。它具有广泛的底物特异性，能够催化自然界所有嘌呤、嘧啶脱氧核糖核酸的磷酸化反应，并且这种激酶还表现出惊人的催化效率，要高出我们所曾了解的核酸激酶效率的10-100倍。研究者们研究显示Dm-dNK可以在人类癌细胞中表达并存留其活性，如在骨肉瘤中，表达Dm-dNK的肿瘤细胞还显示出它对多种化疗药物敏感性的增强。Dm-dN通过磷酸化核苷酸类似物，使其从一磷酸化形式随后被细胞内的其他酶类二三步磷酸化，三磷酸化核苷酸类似物通过DNA复制的终止而引起细胞的凋亡。另有研究显示，基因突变可以提高自杀基因Dm-dNK的酶活性，从而更有效地杀伤肿瘤细胞。　　 慢病毒载体是近来受到广泛注意的一种逆转录病毒载体，由于具有可感染分裂细胞和非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达等优点，适于基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。　　 我们构建了慢病毒载体携带Dm-dNK，进一步我们在体外，体内试验中检测Dm-dNK的抗肿瘤特性。　　 研究资料与方法：　　 一、细胞培养　　 肿瘤细胞系购买于上海细胞库，正常细胞购买ATCC.细胞使用RPM1640培养基或高糖DMEM培养。培养基中含有10％的血清，双抗。培养环境为37℃，5％CO2.　　 二、慢病毒载体的构建及转染　　 根据Dm-dNK的cDNA，在其两端设计出带EcoRI和BamH的酶切位点的引物，利用聚合酶链式反应(PCR)将Dm-dNK克隆到慢病毒载体PGC-FU中，成为PGC-FU-dNK。另外，将绿色荧光蛋白基因(GFP)克隆到慢病毒载体PGC-FU中，成为PGC-FU-GFP，使得转染率能够通过荧光来观察。用Lipofectamine2000将PGC-FU-dNK质粒与两种包装质粒Phelper1.0和Phelper2.0共转染至293细胞，9-14天出现病毒空斑，应用DNA提取试剂盒提取慢病毒DNA，通过PCR验证后命名为Lenti-CMV-dNK，即CMV调控的带dNK基因的慢病毒。Lenti-GFP用于比较不同细胞系间感染率的区别。　　 三、Dm-dNK基因的表达及酶活性的检测　　 用TRIZOL方法提取纯化Bcap37，SGC-7901和WI-38，感染慢病毒Lenti-CMV-dNK后的细胞系Bcap37，SGC-7901和WI-38，使用反转录PCR试剂盒及Western blotting对目的基因的表达进行检测，　　 酶活性测定通过提取细胞的蛋白，用放射性[3H]标记作为底物的核苷酸药物，混合液在Whatman DE-81滤纸上反应不同时间后经液闪测量仪测定放射活性。　　 四、Dm-dNK基因与核苷类似物联合对癌细胞的杀伤作用　　 稳定转染的细胞Bcap37，SGC-7901和WI-38及未转染的对照细胞铺板，加入不同浓度的dFdC共培养5天后采用MTT法检测细胞增殖情况。　　 癌细胞系Bcap37，SGC-7901以及正常细胞系WI-38铺板，培养基在第二天分别替换为病毒溶液Lenti-CMV-dNK.感染3后，加入不同浓度的dFdC，浓度为0，0.001，0.01，0.1，1，和10μM，共培养3天后采用MTT法检测细胞增殖情况。　　 采用Annexin V.FITC双染凋亡检测试剂盒观察治疗后细胞凋亡情况及凋亡比例。各种细胞铺6孔板加入核苷类药物处理，经Annexin V.FITC和碘化丙锭双重染色后用流式细胞仪分析凋亡比例。　　 五、Dm-dNK基因与核苷类似物联合对裸鼠移植瘤的抑制作用　　 采用100-150 mm3裸鼠皮下种植肿瘤模型，6-7周龄的BALB/C裸鼠皮下注射转染Lenti-CMV-dNK的Bcap37和对照Bcap37细胞.所有治疗组动物在成瘤注射6天后腹腔给药dFdC治疗一个月。对照组动物成瘤注射6天后腹腔给PBS。治疗条件满足后，裸鼠处死剥离瘤体根据公式ab2/2测量瘤体积（a为长径）。　　 结果：　　 Dm-dNK经慢病毒转染至肿瘤细胞后呈高水平表达，并保持其激酶活性。持续磷酸化作为底物的核苷酸类似物dFdC表现出广泛底物特异性及高催化效率。　　 在肿瘤细胞中自杀基因和Dm-dNK联合效应杀伤肿瘤细胞的效果较空载病毒杀伤肿瘤细胞效果明显。　　 感染Dm-dNK的肿瘤细胞可以观察到强烈的联合杀伤效果，在动物实验中同样观察到肿瘤受抑制这一结果。　　 结论：　　 慢病毒载体携带Dm-dNK联合核苷类似物治疗体系可以作为一种新的自杀基因治疗方式，为潜在的肿瘤的靶向治疗提供有力的实验基础。