背景和目的:免疫响应是多种疾病（肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植等）关心的主要焦点。近年来对免疫调节的研究促进了对免疫网络的理解。然而,人们对天然免疫调节获得性免疫的研究较多;反过来,获得性免疫是怎样调节天然免疫的却知之甚少。揭示获得性免疫调节天然免疫的机制,有利于找到疾病中免疫治疗的切入点。为疾病的免疫治疗提供理论基础,为获得性免疫与天然免疫之间搭建新的桥梁。在我们进行胸腺移植过程中出现了这样的现象,当把C57/B6小鼠的皮肤移植到裸鼠身上时,该皮肤移植物在存活较长时间后仍被排斥。若将C57/B6小鼠的胸腺移植到裸鼠体内,则移植到裸鼠身上的C57/B6小鼠的皮肤被接受,不发生排斥反应。结果已经证实过继性转移的胸腺能够重建T细胞系统,那么在受者-裸鼠-身上发现的耐受现象是否是重建T细胞影响的结果?以上的现象都说明T细胞能够以直接或间接的方式影响NK细胞的功能,说明获得性免疫能够调节天然免疫。本课题组的前期研究已经证实激活或耐受的T细胞都能够抑制NK细胞的活性,并且这种抑制作用是APC非依赖的。T细胞是一个非常复杂的群体,那么是哪个亚群对NK细胞的抑制负责?在接下来的研究中发现,抑制NK细胞的T细胞亚群主要是CD4⁺T细胞。那么这个亚群是怎样抑制NK细胞的?众所周知,CD4⁺CD25⁺调节性T细胞在免疫系统中具有调节作用,能够保持机体自稳。那么我们发现的CD4⁺T细胞抑制NK细胞的现象是否是CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的作用?其机制又是怎样的?为此,我们分离BALB/C小鼠脾脏的CD4⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺ T细胞、CD4⁺CD25- T细胞、NK细胞,在体外建立共培养体系,确定各细胞亚群与NK细胞的关系及其机制。通过本研究能够有利于理解免疫系统的平衡,尤其是获得性免疫对天然免疫的影响,这为肿瘤和病毒感染的免疫治疗以及移植排斥反应的控制具有重要意义。方法:一、实验用细胞的获得按Miltenyi的磁珠分选试剂盒说明书操作,分选CD4⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺ T细胞、CD4⁺CD25- T细胞和NK细胞。二、实验用细胞纯度纯化的CD4⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺ T细胞、CD4⁺CD25^- T细胞和NK细胞分别用抗体FITC-anti-CD4（小鼠）和PE-anti-CD25抗体和FITC-anti-CD49b（小鼠）标记,用流式细胞仪进行检测。T细胞内Foxp3表达水平按照调节性T细胞试剂盒染色,用流式细胞仪进行检测。三、NK细胞毒性检测实验本研究采用标准⁵¹Cr 4小时释放法检测NK细胞的杀伤毒性,即:在对数生长的1×10⁶的YAC-1细胞中加入60uCi的⁵¹Cr,用完全培养基补充体积到200ul,37℃孵育120min,摇动/15min,1640完全培养基洗3次,配成1×105/ml.将标记好的YAC-1加入到样品中,NK:YAC-1=50:1。混匀后,培养4小时,取100ul上清,用γ计数仪检测CPM值。通过公式计算样品的释放率和抑制率。⁵¹Cr释放率%=（样品孔cpm值-自然释放孔cpm值）/（最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值）×100%抑制率%=（样品平均释放率%-对照组平均释放率%）/对照组平均释放率%×100%四、淋巴细胞共培养纯化的CD4⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺ T细胞、CD4⁺CD25^- T细胞在体外用ConA激活（10ug/ml）24小时,加入纯化的自体NK细胞共培养。T细胞的分化程度用3H掺入法检测。共培养过程中,NK细胞毒活性用⁵¹Cr 4小时标准释放实验检测。五、体外抗体阻断实验为了检测TGF-β1和CD25分子在CD4⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺T细胞和CD4⁺CD25^-T细胞抑制NK细胞功能中的可能作用,在T细胞激活体系中,加入TGF-β1和CD25分子的阻断抗体（终浓度为10ug/ml）,4小时后,加入NK细胞,在共培养的24、48、72和96小时检测NK细胞的细胞毒活性。六、动物实验体外分离Balb/c小鼠的CD4⁺CD25^- T细胞,用ConA激活（终浓度为10ug/ml）（20小时和40小时）,同时设不激活对照组。1.5×10⁶（100ul）激活的和未激活的CD4⁺CD25^- T细胞和相同体积的生理盐水经尾静脉注入裸鼠体内,20小时后,重复以上操作。32小时后,分离裸鼠的脾脏细胞,以YAC-1为靶细胞,用⁵¹Cr 4小时标准释放实验检测脾细胞的毒性。结果:一、体外ConA激活的CD4⁺T细胞能够显著抑制NK细胞活性ConA激活的CD4⁺T细胞与NK细胞共培养的24、48、72、96小时都能显著（p<0.01）抑制NK细胞活性,其抑制率分别为:25%、31.6%、34.7%和46.5%。二、初始和ConA激活的CD4⁺CD25⁺T细胞都能够显著抑制NK细胞的杀伤毒性初始CD4⁺CD25⁺T细胞和ConA激活的CD4⁺CD25⁺T细胞与NK细胞共培养的24和48小时都能显著抑制（p<0.01）NK细胞活性,其抑制率分别为:50.8%和49.1%;19%和20.9%。三、ConA激活的CD4⁺CD25^-T细胞在体外和体内能够显著抑制NK细胞杀伤毒性初始CD4⁺CD25^-T细胞对NK细胞活性没有影响,而ConA激活的CD4⁺CD25^-T细胞在与NK细胞共培养的24和48小时都能显著抑制（p<0.01）NK细胞活性,其抑制率分别为:31.7%和25.5%。经尾静脉注入裸鼠体内在体外激活或未激活的CD4⁺CD25^-T细胞,72小时后分离裸鼠脾脏细胞检测其对YAC-1的溶解率,结果显示,初始CD4⁺CD25^-T细胞在裸鼠体内对NK细胞的功能没有明显影响,但ConA激活的CD4⁺CD25^-T细胞对NK细胞的杀伤毒性具有显著性抑制（p<0.01）作用,抑制率达到60%。四、TGF-β1和CD25分子在不同的培养体系中具有不同的作用在CD4⁺T细胞与NK细胞的共培养体系中,加入TGF-β1抗体后,并没有逆转CD4⁺T细胞对NK细胞活性的抑制;相反,在ConA激活的CD4⁺T细胞与NK细胞的共培养体系中,TGF-β1抗体反而加强了CD4⁺T细胞对NK细胞的抑制,在共培养的24、48、72和96小时,其抑制率由25%、31.6%、34.7%和46.5%增加到63.8%、59.43%、60.7%和90.9%。TGF-β1抗体显著性增强了ConA激活的CD4⁺ T细胞对NK细胞的抑制;在CD4⁺CD25⁺T细胞与NK细胞的共培养体系中,初始CD4⁺CD25⁺T细胞对NK细胞活性的抑制被抗TGF-β1抗体逆转;在ConA激活的CD4⁺CD25⁺T细胞与NK细胞的共培养体系中,加入抗TGF-β1抗体后,其抑制率由原来的19%（24h）、49.1%（48h）变为31.9%（24h）、35.9%（48h）;在CD4⁺CD25^-T细胞与NK细胞的共培养体系中,加入TGF-β1抗体后,并没有减弱CD4⁺CD25^-T细胞对NK细胞活性的抑制;相反,在ConA激活的CD4⁺CD25^-T细胞与NK细胞的共培养体系中,抗TGF-β1抗体反而增强了CD4⁺CD25^-T细胞对NK细胞的抑制,在共培养的24和48小时,其抑制率由31 .65%和44.56%增加到47.26%和68.24%。TGF-β1抗体显著增强了ConA激活的CD4⁺CD25^-T细胞对NK细胞的抑制。在CD4⁺CD25⁺T细胞与NK细胞的共培养体系中,加入抗CD25抗体后,初始CD4⁺CD25⁺T细胞和ConA激活的CD4⁺CD25⁺T细胞对NK细胞活性的抑制均被CD25抗体逆转;而在CD4⁺CD25^-T细胞与NK细胞的共培养体系中,加入CD25抗体后,在其共培养的24和48小时,其抑制率由31 .65%和20.64%减少到25.2%和16.3%。五、ConA激活的CD4⁺CD25^-T细胞上CD25分子与Foxp3的表达未激活的CD4⁺CD25^-T细胞几乎不表达CD25分子,而激活的CD4⁺CD25^-T细胞则表达48.54%的CD25分子;未激活的CD4⁺CD25^-T细胞表达微量的Foxp3（0.17%）,激活的CD4⁺CD25^-T细胞表达Foxp3的百分比有所增加,达到0.95%。结论:我们首次证实ConA激活的CD4⁺T细胞,CD4⁺CD25⁺ T细胞和CD4⁺CD25^- T细胞在体外能显著抑制NK细胞的杀伤毒性。其中,ConA激活的CD4⁺CD25^- T细胞是一类首次发现的全新的获得性调节性T细胞,它的特征是CD4⁺Foxp3-,部分表达CD25,其调节机制不同于CD4⁺CD25⁺ Foxp3⁺T细胞和CD4⁺CD25⁺ Foxp3-T细胞。这些发现为我们理解免疫网络平衡,获得性免疫与天然免疫之间的调节具有重要意义,是天然免疫和获得性免疫之间新的桥梁。