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背景在脊髓发育过程中,产生于背部的连合纤维沿固定轨迹投射到脊髓对侧,而神经元从神经上皮祖细胞区域迁移到正确的位置,才能形成正确的组织结构和神经回路,发挥脊髓信息传递的功能。Wnt3a作为Wnt家族的重要成员,参与多种细胞功能,包括自我更新、增殖、分化以及迁移。有关Wnt3a在脊髓损伤修复方面的功能已有研究,但其在胚胎脊髓发育过程中功能(如调控神经元迁移、连合纤维投射等)研究国内外尚属空白。目的1.研究Wnt3a异位表达对脊髓连合纤维投射及神经元迁移的影响。2.探索Wnt3a过表达对神经细胞及相关分子表达的影响。方法1.通过RNA提取、PCR扩增、酶切和连接等常规分子生物学技术将Wnt3a基因克隆到pCAGGS-EGFP载体上,再进行菌落PCR和酶切验证,最后进行基因测序。2.利用脂质体转染技术将Wnt3a过表达载体(pCAGGS-EGFP-Wnt3a)转入SH-SY5Y细胞,提取蛋白,再利用Western blot技术检测Wnt3a表达情况。另外,利用鸡胚活体原位电转基因技术将pCAGGS-EGFP-Wnt3a转入E2.8鸡胚脊髓中,E4取材切片,通过免疫荧光检测Wnt3a表达情况。3.将pCAGGS-EGFP-Wnt3a或pCAGGS-EGFP转入E2.8鸡胚脊髓中,E6时取绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)阳性胚胎,一部分材料进行组织切片,每组至少5个材料,利用免疫荧光检测Wnt3a,Pax7,Map2和MNR2的表达情况,同时利用GFP示踪检测Wnt3a异位表达后对神经元形态及迁移的影响。另一部分材料用于神经元的提取培养,检测体外条件下Wnt3a异位表达对神经元形态的影响。4.将pCAGGS-EGFP-Wnt3a或pCAGGS-EGFP转入SH-SY5Y细胞,利用免疫荧光检测Tubulin的表达,并观察细胞形态变化;提取蛋白,利用Western blot技术检测β-catenin,CyclinD1,C-myc,PCNA,Caspase3和Bcl-2的表达情况。结果1.菌落PCR,酶切验证以及基因测序结果表明成功构建了pCAGGS-EGFP-Wnt3a载体。2.pCAGGS-EGFP-Wnt3a转染的SH-SY5Y细胞的Western blot及脊髓切片免疫荧光结果表明,Wnt3a在SH-SY5Y细胞和脊髓中表达量增加。3.在E6鸡胚脊髓中,Wnt3a异位表达后,连合纤维未投射到对侧,绝大多数GFP阳性神经元滞留在VZ区,且无法伸出突起或伸出较短的突起。免疫荧光结果表明,Map2阳性表达区域减少,MNR2阳性神经元数量明显减少且大部分滞留在VZ区,而Pax7的表达没有明显差异。脊髓神经元分离培养的结果显示,pCAGGS-EGFP-Wnt3a转染的神经元呈球形或伸出较短的突起。4.pCAGGS-EGFP-Wnt3a转染的SH-SY5Y细胞的Tubulin免疫荧光结果显示,绝大部分细胞无法伸出突起或突起变短;Western blot的结果表明实验组中β-catenin,C-myc以及PCNA的表达量明显增加,Bcl-2的表达量下调,而CyclinD1和Caspase3的表达量没有明显差异。结论1.Wnt3a异位表达抑制脊髓连合纤维投射;2.Wnt3a异位表达调节神经元形态进而影响迁移;3.Wnt3a通过β-catenin信号通路调控细胞增殖与凋亡。