原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤,其发病率居于肿瘤发病率的第六位,而病死率仅次于肺癌,我国肝癌患者占全球肝癌患者总数的一半以上,死亡率也居高不下。已确定诱发肝癌的因素包括乙肝或丙肝病毒感染、黄曲霉毒素、酒精等,新增的风险因素包括糖尿病、肥胖,非酒精性脂肪肝等。肝脏是乙醇代谢的主要器官,长期过量饮酒严重损伤肝脏,导致脂肪肝、肝硬化,明显增加肝癌的罹患率。第一部分:乙醇促进HepG2细胞表达、分泌VASN蛋白及对HUVEC细胞迁移的影响。VASN蛋白是一种典型的Ⅰ型跨膜蛋白,包含串联的亮氨酸结构域,类表皮生长因子结构域和纤联蛋白Ⅲ结构域,其可以被金属蛋白酶ADAM17剪切,从细胞膜上脱落分泌至细胞外,产生可溶性VASN蛋白(sVASN)。人VASN蛋白主要表达于主动脉的血管平滑肌细胞、肾脏、胎盘组织等,其它组织中表达水平低。有报道显示,乳腺癌细胞高表达VASN蛋白,其分泌的sVASN蛋白能够抑制TGFβ信号通路的激活,发挥促肿瘤的作用。VASN在人脑肿瘤组织、细胞中高表达,当siRNA敲低胶质细胞瘤中VASN表达水平,低氧或TNF-α诱导的细胞凋亡率明显升高,提示VASN可能具有抗低氧诱导凋亡、促进肿瘤进展的作用。我们实验室前期工作中,利用SELEX技术从肝癌患者血清中筛选出潜在的肝癌生物标志物VASN蛋白,并且证实VASN蛋白在肝癌细胞、肝癌组织中高表达。进一步实验表明,HepG2来源的外泌体形式VASN能够促进HUVEC细胞迁移。长期慢性乙醇刺激导致HepG2细胞多种基因表达水平的改变,影响急性应激反应、氨基酸代谢,碳代谢以及脂质代谢等途径。本部分将利用乙醇刺激HepG2细胞,检测VASN蛋白的表达变化及其可能对HUVEC细胞的影响。为模拟日常生活中的中度、重度饮酒以及酗酒,我们选取与之相对应的25、50、100mM三种乙醇浓度对HepG2细胞进行刺激。乙醇刺激不同时间(24、48、72h)后,我们提取细胞总RNA,qPCR检测发现三种浓度乙醇刺激均可导致VASN蛋白的mRNA水平显著上升;细胞总蛋白Western Blot结果显示,三种浓度乙醇均促进VASN蛋白表达。收集乙醇刺激后的上清进行浓缩,检测其中VASN蛋白水平,Western Blot结果显示,上清中VASN蛋白水平在乙醇刺激后显著上升。以上结果表明乙醇刺激可以促进HepG2细胞VASN蛋白的表达与分泌。VASN蛋白不仅可以被金属蛋白酶ADAM17剪切,胞外结构域脱落成为sVASN;而我们前期工作发现,VASN蛋白还存在于肝癌细胞分泌的外泌体中。乙醇刺激可以促进HepG2细胞培养上清中VASN蛋白水平升高,究竟是何种形式的VASN分泌增加,我们进行了探讨。我们利用外泌体提取试剂从乙醇刺激的细胞培养上清中纯化外泌体,同时收集去除外泌体的细胞上清。通过对外泌体进行蛋白定量分析,结果显示乙醇刺激后外泌体的总蛋白量显著升高;同时westernblot检测外泌体标志分子hsp70蛋白水平,发现乙醇刺激后hsp70蛋白明显上升,其结果与蛋白定量相一致,表明乙醇可以促进hepg2细胞分泌外泌体。检测外泌体中vasn蛋白,westernblot结果显示乙醇处理组的外泌体中vasn蛋白水平升高。同时我们也检测了去除外泌体的细胞上清中svasn水平,结果表明,乙醇刺激也可以促进hepg2分泌svasn。我们进一步研究乙醇促进hepg2细胞表达分泌vasn蛋白,对于huvec细胞会产生怎样影响。我们使用上述浓度乙醇刺激huvec细胞,结果发现huvec细胞的迁移明显受到抑制。随后,我们将hepg2细胞与huvec细胞共培养,结果发现,在乙醇刺激条件下,相对于单独培养的huvec细胞,与正常hepg2细胞共培养的huvec细胞迁移速率明显加快,细胞穿膜数量增加,而与敲低vasn的hepg2细胞共培养的huvec细胞迁移速率则无明显变化,细胞穿膜数量显著减少,说明乙醇刺激hepg2细胞分泌vasn,而vasn在促进huvec细胞迁移,趋化过程中发挥重要作用。上述结果提示,乙醇促进hepg2细胞表达、分泌vasn蛋白,调节vasn蛋白介导的hepg2与huvec细胞间的“通讯”。本研究有助于阐明乙醇在肝癌发生发展中的作用;同时,vasn作为肝癌组织微环境中的重要组分,也可能成为肝癌防治药物的候选靶分子。第二部分:致死量乙醇短时间刺激hepg2细胞膜泡产生的初步观察乙醇通过多种机制影响细胞的生命活动,不同浓度乙醇作用有所不同。100mm乙醇可以促进肝癌细胞的迁移、肿瘤血管生成以及外泌体的分泌,而1.5m乙醇可以显著增加胰腺导管腺癌细胞的细胞膜通透性,直接将无水乙醇注入肝癌肿瘤中央,可以使肿瘤细胞及附近血管内皮细胞迅速脱水,引发细胞内蛋白质凝固变性,从而导致肿瘤细胞坏死。细胞皮层(cellcortex)是一层富含肌动蛋白的结构,紧贴细胞质膜的细胞质区域,牵引临近的肌动蛋白微丝,形成外膜张力。当皮层与质膜的结合处破坏或皮层溶解,细胞质就会流向这些位点,流体压力导致质膜膨出,形成“膜泡”(bleb)。细胞膜泡通常在细胞膜上可以发展到2μm,然后可以收缩至膜泡起始部位。膜泡见于许多细胞活动过程,在细胞的三维运动中至关重要,如细胞运动、肿瘤细胞侵袭、凋亡、应激反应过程中。我们发现2m乙醇刺激hepg2细胞膜泡形成。我们对细胞膜泡进行了形态学观察,一部分细胞膜泡会随着乙醇处理时间的延长而在细胞膜表面发生融合、收缩,一部分细胞膜泡会从细胞表面脱落,悬浮在培养基中。我们对乙醇诱导细胞膜泡产生的浓度进行摸索,结果显示100mm、400mm乙醇长期间刺激都不能诱导膜泡的生成,而在2m乙醇刺激10min时,我们就可以观察到大量细胞膜泡的产生。我们利用台盼蓝对2m乙醇刺激的膜泡细胞进行染色,发现细胞膜通透性增强;通过扫描电镜观察膜泡细胞,结果发现乙醇刺激使细胞表面变得粗糙,微绒毛消失,膜泡突出,膜泡细胞与基质连接减弱,部分细胞表面出现孔洞。利用染料Dil与鬼笔环肽分别对细胞膜与肌动蛋白进行染色,荧光显微镜观察,结果发现乙醇刺激后细胞膜泡从细胞膜上突出,变圆,膜泡内含有细胞质成分,但是不含有细胞骨架中的肌动蛋白,说明细胞膜脱离细胞骨架,致使细胞形态发生变化。最后,我们检测了细胞膜泡率与细胞死亡率。实验结果表明,细胞膜泡率与死亡率随乙醇刺激时间的延长而增加,结合对细胞形态学的分析,可以发现,大部分膜泡细胞的最终命运是死亡,但仍有极少数细胞存活,并且能够继续增殖。此外,我们收集了细胞外囊泡进行检测,结果表明,2M乙醇明显促进细胞外囊泡的分泌,这些囊泡具有怎样的生物学功能尚不明确。本部分初步探讨了致死量乙醇对HepG2细胞的影响,我们发现2M乙醇诱导细胞外囊泡的分泌、膜泡形成、大量细胞死亡,但仍有少量膜泡细胞存活。今后我们将继续研究产生乙醇“耐受”的膜泡细胞生物学特性与功能,膜泡与细胞外囊泡的组成及其生物学功能。