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奶牛乳房炎（Bovine mastitis）是奶牛养殖中最常见的疾病,给奶牛养殖行业造成严重的经济损失。奶牛乳房炎的有效防治,是奶牛养殖中亟待解决的问题,也是全球的研究热点。目前有关湖北地区奶牛乳房炎主要致病菌的研究较少,本研究对湖北地区5个规模化奶牛场的样品进行大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonellas）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulase-negative staphylococci,CNS）、乳房链球菌（Streptococcus uberis）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）的分离鉴定,并测定分离株对抗菌药物的敏感性;采用PCR技术和二代全基因组测序的方法,深入研究了金黄色葡萄球菌分离株的基因型、血清型及其毒力基因和耐药基因的相关性及其分子特征之间的关系,为临床奶牛乳房炎的精准防控提供理论基础,为临床合理用药、降低细菌耐药性的产生提供科学依据。1.样品采集和主要致病菌的分离鉴定采集健康奶牛、亚临床乳房炎（subclinical mastitis,SCM）和临床型乳房炎（clinical mastitis,CM）奶牛的奶样、乳头皮肤拭子、肛门拭子及环境样品共计887份,其中包括健康乳96份,SCM乳49份,CM乳138份,健康奶牛乳头皮肤拭子95份,SCM乳头皮肤拭子39份,CM乳头皮肤拭子78份,健康奶牛肛门拭子97份,SCM肛门拭子33份,CM奶牛肛门拭子80份,饲料、垫料、粪便、饮用水、喷淋水、清洗水、空气、奶杯拭子等环境样品182份。每份样品增菌后,采用不同的选择培养基进行致病菌培养和分离鉴定。通过特异性引物和16S r DNA通用引物PCR扩增后鉴定菌株,共分离鉴定大肠杆菌407株,金黄色葡萄球菌100株,乳房链球菌37株,无乳链球菌3株,凝固酶阴性葡萄球菌134株,沙门氏菌和停乳链球菌分离率均为0。大肠杆菌是引起奶牛乳房炎感染最主要的致病菌,在临床型奶牛乳房炎乳汁中大肠杆菌的分离率（37.7%）,显著高于其他致病菌的分离率。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌在健康牛乳和SCM乳的分离率均高于CM乳,可能与奶牛用药有关。在多种环境样品中检出上述致病菌,且大肠杆菌在环境中的分离率（46.2%）高于其他致病菌。B、C奶牛场致病菌的分离率普遍偏高,不同奶牛场分离率的差异与奶牛的饲养管理方式和奶牛场的环境等因素有关。2.致病菌的抗菌药敏感性测定采用微量肉汤稀释法对分离株进行抗菌药物敏感性实验。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均对β-内酰胺类和磺胺类药物耐药严重。大肠杆菌环丙沙星、多粘菌素、利福昔明、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、美罗培南、头孢噻呋、阿莫西林/克拉维酸敏感率均大于50%,对氨苄西林、头孢噻吩、四环素、氟苯尼考、磺胺异噁唑、复方新诺明的耐药率均高于50%。多重耐药（multidrug-resistant,MDR）率为79.4%,MDR菌株最多对9种药物产生耐药。金黄色葡萄球菌对复方新诺明、万古霉素、氧氟沙星、恩诺沙星和红霉素敏感性均高于50%,对青霉素、阿莫西林/克拉维酸和磺胺异恶唑耐药率大于50%。MDR菌株最高表现为4重耐药,以3重耐药为主。凝固酶阴性葡萄球菌均为MDR菌株,最多对11种药物产生耐药,以5重耐药为优势耐药菌群,对替米考星、红霉素、庆大霉素、多西环素、氟苯尼考、苯唑西林、万古霉素、利奈唑胺敏感,对磺胺类、头孢类和氟喹诺酮类药物耐药。链球菌对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻吩、头孢噻呋、庆大霉素、氟苯尼考、利福昔明、万古霉素、环丙沙星、氧氟沙星敏感,对苯唑西林、青霉素、多西环素、红霉素、磺胺异噁唑、复方新诺明、林可霉素和克林霉素耐药率均高于50%。MDR菌株最高表现为7重耐药,以5重耐药为优势耐药菌群。3.金黄色葡萄球菌血清分型和MLST分型根据全基因测序结果,100株金黄色葡萄球菌检出ST 25、ST 2683、ST 389、ST 188、ST 705和ST 7462共6种ST型,以ST 2683（46%）和ST 25（35%）为优势ST型,ST 7462为本研究发现的新的ST型。42%的菌株为cap5血清型,55%为cap8血清型,3%既不是cap5也不是cap8血清型。ST 25型的菌株均为cap5血清型,ST2683和ST 188菌株均为cap8血清型,ST 398型菌株80%（8/10）为cap5血清型,其余ST 398菌株既不是cap5也不是cap8血清型。100株金黄色葡萄球菌的6种ST型主要构成了4个克隆复合体CC25、CC151、CC479和CC398。4.金黄色葡萄球菌耐药基因和毒力基因根据金黄色葡萄球菌全基因组测序结果,筛选出氟喹诺酮类、四环素类、青霉素类等耐药基因共45种。青霉素类、氟喹诺酮类和大环内酯类耐药基因与耐药表型的符合率为100%,磺胺类为59.1%。所有菌株均检出大环内酯类耐药基因,但仅有12%的菌株对大环内酯类抗菌药耐药,氟喹诺酮类、四环素类、氨基苷类耐药基因检出率高于90%,菌株却对这些抗菌药完全敏感,耐药基因与耐药表型的这种差异说明耐药性的产生可能是由多种因素相互作用产生的。金黄色葡萄球菌共检出5类95种毒力基因,包括粘附因子类、酶类、免疫逃避类、分泌系统类和毒素类。毒素类相关毒力基因检出率最高（46.3%,44/95）,包括肠毒素基因seb（20%）、seg（81%）、sec（1%）和sei（45%）,溶血素基因hly/hla（99%）、hlb（1%）、hlg A（99%）、hlg B（99%）和hlg C（99%）。金黄色葡萄球菌的进化关系说明金黄色葡萄球菌的ST型、血清型和毒力基因之间存在一定的联系。且同一奶牛场部分从乳头乳、乳头皮肤拭子、肛门拭子、饲料、空气、垫料和粪便中分离出的金黄色葡萄球菌具有同源性,这表明金黄色葡萄球菌对奶牛乳汁的感染可能与乳头皮肤和奶牛场的环境卫生有关。综上所述,引起湖北地区奶牛乳房炎的致病菌以大肠杆菌和葡萄球菌为主,其中大肠杆菌也是引起奶牛乳汁感染的主要致病菌。5种致病菌主要对β-内酰胺类和磺胺类药物耐药严重,且多重耐药率高,临床应合理选择药物进行奶牛乳房炎的治疗,以减少耐药性的产生。奶牛乳房炎的发生与奶牛乳头皮肤的污染和养殖环境密切相关,养殖人员应给予重点关注。金黄色葡萄球菌的血清型、ST型和毒力基因之间存在联系,金黄色葡萄球菌耐药基因的检测为耐药性的产生提供初步依据。本研究为奶牛乳房炎的精准防治提供理论基础,为临床合理用药、降低细菌耐药性的产生、减少奶牛养殖中致病菌的感染提供科学依据。