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背景与目的T淋巴细胞是细胞免疫的主要效应细胞,其活化程度直接影响抗肿瘤治疗效果。调控T细胞增殖成为效应细胞需要抗原肽-MHC分子复合物介导的特异性刺激信号和B7、4-1BBL等分子提供的共刺激信号。如果在增殖分化过程中未能获得共刺激信号,T细胞可能会出现活化诱导的细胞死亡(activation-induced cell death, AICD)或者无能状态,进而导致抗肿瘤免疫功能低下。而通过低表达共刺激分子降低免疫原性,使得识别它的抗原提呈细胞或淋巴细胞得不到充分的活化信号,是肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制之一。本课题通过克隆人4-1BBL胞膜外区及构建4-1BBL/anti-CD20融合蛋白来激活T细胞表面4-1BB信号通路、通过联合应用阿糖胞苷提高靶细胞表面B7分子的表达水平达到提高共刺激信号的目的,以促进淋巴细胞的活化,增强抗肿瘤免疫反应,更好地抑制肿瘤甚至彻底清除肿瘤。方法与结果第一部分实验中,体外用CytoTox96Nonradioactived Assay kit检测了4-1BBL胞膜外区蛋白联合anti-CD3/anti-Pgp微型双特异抗体对靶向的K562/A02细胞的细胞毒作用,用Calcein-AM法检测了4-1BBL胞膜外区蛋白及4-1BBL/anti-CD20融合蛋白联合anti-CD3/anti-CD20微型双特异抗体对靶向的Raji细胞的细胞毒作用,证明增强4-1BBL信号确实能够提高T细胞杀伤效果,而具有CD20和4-1BBL双靶向的融合蛋白激活信号能力较单一的4-1BBL分子更为理想,联合杀伤效果更为突出。在体内联合应用4-1BBL胞膜外区蛋白和anti-CD3/anti-Pgp治疗裸鼠K562/A02移植瘤,联合应用4-1BBL/anti-CD20和anti-CD3/anti-CD20治疗裸鼠Raji移植瘤,显著控制了肿瘤的生长并清除肿瘤,观察至100天未见肿瘤复发。第二部分实验中,取不同终浓度的抗代谢类化疗药阿糖胞苷(Ara-C),作用靶细胞72h,FACS测定B7分子(CD80和CD86)表达。取不同终浓度Ara-C作用靶细胞72h,MTT法检测Ara-C对靶细胞的抑制率。确定使靶细胞CD80和CD86表达升高但又不产生抑制效果的Ara-C终浓度0.251μmol/l。Calcein-AM法测定双功能抗体联合Ara-C的体外杀伤活性,杀伤效果比未经Ara-C处理的效果明显(p<0.05)。体内采用K562/A02细胞移植瘤模型,联合阿糖胞苷和anti-CD3/anti-PGP Diabody治疗,效果优于双功能抗体单用,并且对防止肿瘤二次复发有很好效果。结论4-1BBL、4-1BBL/anti-CD20和anti-CD3/anti-Pgp、anti-CD3/anti-CD20联合使用体内外均有效激活T细胞,增强其杀伤作用。非抑制剂量化疗药阿糖胞苷使靶细胞CD80表达升高,再联合双功能抗体使体外介导T细胞杀伤靶细胞的效果提高近20%。体内K562/A02移植瘤模型也证实阿糖胞苷在双功能抗体的治疗中起到重要辅助作用,可以有效提升疗效。以上结果均说明共刺激途径的激活对于维持和提高T细胞杀伤能力是至关重要的。