论文部分内容阅读
研究背景运动病(motion sickness,MS)又称晕动病,是一种常见的由于异常加速度刺激引起的以眩晕、皮肤苍白、出冷汗、流涎、上腹不适,乃至恶心、呕吐等植物神经反应为主的前庭功能紊乱。晕船做为一种运动病,是舰船员常见的航海卫生学问题,发生率较高。晕船会给船员带来不同程度的生理不适及精神和心理负担,降低船员的体能、工作效率及应急反应能力。因此,深入研究晕船的原因和发生机制,探索晕船防治新途径,对提高航海作业人员的工作效率和生活质量,提高部队舰船员的战斗力具有重要的现实意义。大鼠是运动病研究常用动物模型之一,但大鼠没有呕吐反射,这给大鼠运动病评价带来困难。国内外学者常采用异食癖(如高岭土)作为大鼠运动病严重程度的评价方法。近年来,有学者以大鼠晕动病刺激后的排便颗粒数、排尿量等表现作为运动病的评价指标,即晕反应指数(Motion sickness index,MSI)。与高岭土摄人量和自发活动值相比,该评价指标具有准确性和可重复性。目前国内外没有一个公认的大鼠运动病生物学评价指标,有研究表明血清精氨酸加压素(Arginine vasopressin, AVP)、促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)、糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)、胰岛素(Insulin)、一些微量元素(Traceelements)如铜(Copper,Cu)、铁(Iron,Fe)、锌(Zinc,Zn)以及前庭c-Fos的蛋白表达等可能与运动病有关。研究目的以晕反应指数作为大鼠运动病的评价指标,对晕反应指数与运动病可能相关的生物学指标进行相关性分析,为建立更为完善的运动病评价指标体系提供实验依据。研究方法通过文献回顾筛选出几个可能与运动病有关的生物学指标。以晕反应指数作为大鼠运动病的评价指标,分析在模拟晕船刺激条件下血清AVP、ACTH、糖皮质激素、胰岛素、微量元素Cu、Fe、Zn水平以及脑内前庭核c-Fos蛋白表达水平的变化是否与晕反应指数的变化存在一定的联系。具体包括以下几个部分:一、模拟晕船刺激条件下大鼠晕反应指数与部分血清激素和微量元素含量变化的相关性分析(一)实验动物42只健康雄性SD大鼠(购自上海西普尔-必凯公司),体重228±12g。动物饲养室环境温度22℃±2℃,湿度50%~60%,自由摄食和饮水,自然昼夜节律光照。(二)大鼠运动病模型制作本实验通过旋转装置加速度暴露模拟晕船刺激。将SD大鼠无束缚地放入旋转装置的有机玻璃笼内,盖上笼盖,启动装置,持续旋转刺激1小时。旋转参数如下:绕水平轴顺时针旋转,以16°/s2的角加速度从0加速至120°/s2,立即以48°/s2的角加速度减速,直至旋转停止为1个旋转周期,如此反复。(三)晕反应指数评分大鼠加速度刺激后,立即记录实验大鼠晕反应指数。大鼠晕反应指数计算方法如下:粪便颗粒:每粒计1分,无为0分;排尿:有计1.2分,无为0分;立毛:重度为1.2分,轻度为0.6分,无为0分;颤抖:有为1.2分,无为0分。晕反应指数最终评分结果为各项计分之总。(四)检测指标与方法1、取材大鼠加速度暴露刺激后,记录晕反应指数,断头处死取血。血液2000rpm×30min×4°C离心后取上清,置于-80°C保存待测。2、指标检测(1)血清激素检测血清中胰岛素、糖皮质激素(皮质酮,corticosterone)、AVP和ACTH含量检测方法为放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)。(2)血清微量元素检测利用电感耦合等离子体(inductively coupled argon plasma quantifier, IcAP)检测血清微量元素Cu、Fe、Zn含量。血清样品稀释方法为取0.2ml血清,去离子水稀释至5ml上机检测。二、血清胰岛素水平改变对大鼠晕反应指数的影响(一)实验动物与分组48只健康雄性SD成年大鼠(购自上海西普尔-必凯公司),体重259±32g。动物饲养室环境温度22℃±2℃,湿度50%~60%,自由饮水和摄食,自然昼夜节律变化光照。经过适应性喂养后,大鼠被随机分为空白对照组(n=8)、链脲霉素(Streptozocin,STZ)组(n=8)、胰岛素组(n=8)、单纯旋转组(n=8)、STZ+旋转组(n=8)和胰岛素+旋转组(n=8)。(二)药物诱导血清胰岛素变化动物模型制作1、大鼠STZ给药STZ组和STZ+旋转组大鼠禁食不禁水12小时后,腹腔注射STZ65mg/kg,所有大鼠在25分钟完成注射给药。2、大鼠胰岛素给药胰岛素组和胰岛素+旋转组中的大鼠分批于旋转前30分钟腹腔注射2IU/kg胰岛素。(三)大鼠晕动病模型制作大鼠晕动病模型制作装置和加速度刺激条件与前面相同。将胰岛素+旋转组大鼠提前30min腹腔注射2IU/kg胰岛素,与单纯旋转组、STZ+旋转组大鼠分批放入装置中模拟晕船刺激。胰岛素组与空白对照组、STZ组大鼠分(四)晕反应指数评分大鼠模拟晕船刺激后,立即记录实验大鼠排便立毛颤抖等情况,并计算晕反应指数,具体计算方法同前。(五)检测指标与方法1、取材大鼠模拟晕船刺激后,立即记录晕反应指数,断头处死取血。胰岛素组与空白对照组、STZ组大鼠分批静置1小时后,与其他各旋转组大鼠一起处死取血。血液2000rpm×30min×4°C离心后取上清,置于-80°C保存待测。2、指标检测RIA法检测血清胰岛素水平。三、模拟晕船刺激条件下晕反应指数与大鼠前庭核c-Fos蛋白表达水平的关系研究(一)实验动物30只健康雄性SD大鼠(购自上海西普尔-必凯公司),体重264±15g。动物饲养室环境温度22℃±2℃,湿度50%~60%,给予摄食和饮水,自然昼夜节律光照。(二)大鼠运动病模型制作大鼠运动病模型制作装置和加速度刺激条件同前。旋转刺激1小时。(三)晕反应指数评分与分组旋转刺激后,记录晕反应指数。晕反应指数评分方法同前。按四分位间距法取上四分位数和下四分位数为高低晕反应指数组,每组6只,其余旋转组样本剔除。(四)检测指标与方法1、取材SD雄性大鼠模拟晕船刺激结束记录晕反应指数后,立即断头处死。于冰片上迅速取下前庭核。2、指标检测Western blot测定前庭核c-Fos蛋白表达量。四、统计方法实验数据用SPSS16.0软件进行处理。数据以均数±标准误表示。P<0.05认为差异有统计学意义。三组及三组以上均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),两组间差异的显著性比较用Least Significant Difference (LSD)法。以晕反应指数为Y,各激素和微量元素指标分别为X,p=0.5为纳入标准,p=1.0为剔除标准进行简单线性回归分析;以p=0.05为纳入标准,p=0.10为剔除标准进行多元线性回归,分析晕反应指数与纳入指标的关系。结果一、模拟晕船刺激条件下大鼠晕反应指数与部分血清激素和微量元素含量变化的相关性分析以晕反应指数为应变量Y,血清胰岛素、皮质酮、ACTH、AVP、Cu、Fe和Zn含量分别为X变量,进行简单线性回归分析,p=0.5为纳入标准,p=1.0为剔除标准纳入Cu、Zn、皮质酮、AVP和胰岛素5个指标分别为X1、X2、X3、X3、X5,以晕反应指数为Y进行多元逐步线性回归,以p=0.05为纳入标准,以p=0.10为剔除标准,回归模型成立(p<0.05)。模拟晕船刺激后大鼠血清胰岛素水平与晕反应指数存在负相关关系。二、血清胰岛素水平改变对大鼠晕反应指数的影响STZ给药后,大鼠血清胰岛素水平下降;胰岛素给药后,大鼠血清胰岛素水平上升,且差异有统计学意义(p<0.05)。与空白对照组相比,模拟晕船刺激后单纯旋转组大鼠晕反应指数明显增加(p<0.05);与空白对照组相比,模拟晕船刺激后STZ+旋转组大鼠晕反应指数增加(p<0.05);与空白对照组相比,模拟晕船刺激后胰岛素+旋转组大鼠晕反应指数差异无统计学意义(p>0.05)与单纯旋转组相比,胰岛素+旋转组大鼠晕反应指数下降,差异有统计学意义(p<0.05);与单纯旋转组相比,STZ+旋转组大鼠晕反应指数差异无统计学意义(p>0.05)。胰岛素+旋转组大鼠晕反应指数低于STZ+旋转组,且差异有统计学意义(p<0.05)。三、模拟晕船刺激条件下晕反应指数与大鼠前庭核c-Fos蛋白表达水平的关系研究模拟晕船刺激后,空白对照组、低晕反应指数组和高晕反应指数组三组大鼠前庭c-Fos蛋白表达水平差异具有统计学意义(p<0.05)。与空白对照组比,高晕反应指数组大鼠c-Fos蛋白表达水平上升,且差异有统计学意义(p<0.05)。高晕反应指数组比低晕反应指数组大鼠c-Fos蛋白表达水平高,差异有统计学意义(p<0.05)。结论本实验以晕反应指数作为大鼠运动病的评价指标,检测大鼠模拟晕船刺激后与血清胰岛素、糖皮质激素、ACTH和精氨酸加压素水平,以及血清铜、铁、锌水平和前庭c-Fos蛋白表达水平,分析这些指标与晕反应指数的相关性,结果发现血清胰岛素水平与晕反应指数相关。为进一步探讨晕刺激下血清胰岛素浓度与晕反应指数的相关性,通过STZ给药破坏SD雄性成年大鼠的胰岛β细胞,降低血清胰岛素水平;以及直接胰岛素给药,增加大鼠血清胰岛素水平的方式,观察两种不同处理方式的大鼠模拟晕船刺激后晕反应指数的变化情况,结果发现胰岛素注射大鼠晕船刺激后晕反应指数下降。模拟晕船刺激后不同晕反应指数组前庭c-Fos蛋白表达水平不同。综上说明血清胰岛素浓度和前庭c-Fos有可能成为运动病的生物学评价指标,但具体应用还有待于进一步明确。