家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是一种家蚕常见的致病真菌,其引发的家蚕微粒子病是蚕桑产业中毁灭性的病害,因此家蚕微孢子虫一直被各养蚕国家和地区列为法定的蚕业生产检疫对象。为有效控制蚕业生产中因家蚕微孢子虫引发的家蚕微粒子病,以免其引发家蚕死亡,如何在成品卵阶段完成家蚕微孢子虫的检测成为蚕业科学研究中的重要工作之一。目前蚕业生产中常用的家蚕微孢子虫检测方法为母蛾镜检法,属于间接检查,其操作简单方便、结果直观易懂,但由于其对检测人员要求很高,母蛾样品准备繁琐,同时在镜检工作中容易将家蚕微孢子虫与花粉粒、曲霉孢子等混淆,降低了检测工作的速度和准确度,因此建立直接检测成品卵中家蚕微孢子虫的方法已成为蚕业科学研究的重点。PCR技术是分子生物学实验室的常用技术手段,因准确、灵敏的优势成为了临床及实验室病原微生物检测的常用方法。免疫侧向层析试纸条检测法操作方便快捷,造价低廉,易在基层推广,目前已在病原微生物或者临床检测的工作中占据了重要的地位。本研究旨在于联合核酸扩增技术与免疫侧向层析试纸条技术建立一种操作简单、特异性强、灵敏度高的核酸侧向层析试纸条快速检测方法,为成品卵中家蚕微粒子病的快速检测做出贡献。1.家蚕微孢子虫核酸侧向层析试纸条检测体系的建立以家蚕微孢子虫的LSU rRNA作为扩增靶标,依据其序列设计引物,而后以家蚕微孢子虫基因组为模板通过PCR扩增对引物进行筛选,经琼脂糖核酸电泳选择扩增效率较高的引物对LSU323及LSU480作为候选引物,随后对所选引物进行修饰,在上游引物5’端修饰生物素标签,下游引物5’端修饰羧基荧光素。随后进行无模板的PCR扩增,并利用核酸侧向层析试纸条对产物进行检测,最终选择不形成可检测异源二聚体的引物对LSU323进行后续实验,其上游引物为:5’-Biotin-tctgtcacctccaatcaa-3’,下游引物为:5’-FAM-tatgttatttggtagttgtg-3’。通过对四种不同基因组提取方法的比较,最终确定可高效稳定提取感染家蚕微粒子蚕卵基因组的NPT裂解法作为后续实验的提取方法;随后对不同DNA聚合酶进行测试,最终选择抗逆性较强,扩增效果较好的Mighty Amp?DNA Polymerase为后续所用聚合酶,并对最佳扩增条件进行了确定。本检测方法能把家蚕微孢子虫与家蚕其他常见病原,如粘质沙雷氏菌、家蚕核型多角体病毒、金黄色葡萄球菌、球孢白僵菌区分开来,且对于家蚕微孢子虫DNA的检测限度为10pg,对模拟家蚕微孢子虫感染蚕卵的检测限度为10spores/100粒蚕卵,此结果说明本检测方法的特异性和灵敏度均能满足蚕业生产的要求。与传统的家蚕微孢子虫分子生物学检测方法相比,本检测方法的DNA提取方法快捷高效,所得产物无需纯化即能直接用于检测,大大简化了样品处理的步骤,从样品准备到得到最终结果总耗时约120 min。2.家蚕微孢子虫核酸侧向层析检测试纸条的应用使用家蚕微孢子虫核酸侧向层析试纸条检测带毒母蛾及对应的带毒蚕卵、成品卵(原种及杂交一代种)、4株生产中分离的家蚕微孢子虫分离株。检测结果显示核酸侧向层析试纸条能检测带毒母蛾及对应的带毒蚕卵。检测的29个原种蚕卵样品,其对应母蛾镜检阳性率100%,生产蚁蚕补正检查阳性率17%,用核酸侧向层析试纸条检测,其阳性率为31%;检测的67杂交一代种个样品,其对应的集团母蛾镜检阳性率100%,经催青收蚁开展的补正检查阳性率49%,采用我们建立的核酸侧向层析试纸条方法,其检测阳性率77%。通过对从生产中分离的4株家蚕微孢子虫分离株的检测发现,可以检测出其中3株。基于核酸侧层析试纸条检测结果可知该方法可以有效应用于生产中家蚕微孢子虫感染蚕卵的检测,经改良后也能用于感染母蛾的检测。通过对核酸侧向层析试纸条及琼脂糖凝胶电泳的检测结果的对比,可知核酸侧向层析试纸条呈阳性结果的样品在使用琼脂糖凝胶电泳检测时同样也显示大小正确,条带单一的阳性结果,证明了核酸侧向层析试纸条检测方法的可靠性,重现性好。与传统的母蛾镜检法相比,核酸侧向层析试纸条检测方法能够直接用于蚕卵的检测,其结果更加客观公正,且本方法不依赖检测人员的视力差异,也不受工作环境差异性的影响,能保持检测结果的稳定性及真实性,具有较强的生产实用性。