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目的: 观察雷藤舒(LLDT-8)对TNF-α诱导的RA-HFLS促凋亡作用,以及其对抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax和凋亡关键酶Caspase-3的作用;探讨LLDT-8对TNF-α诱导的RA-HFLS分泌的两种主要细胞因子IL-6、MMP-3的影响,从炎性细胞因子的角度来探讨LLDT-8的抗炎作用;研究LLDT-8对TNF-α诱导的RA-HFLS Ras-MAPKs信号通路的作用机制。从而为LLDT-8治疗RA的分子机制和临床合理应用提供实验依据。 方法: 在体外培养RA-HFLS体系中,加入50nM LLDT-8与20ng/ml TNF-α共孵育,同时设置对照组,采用TUNEL法检测RA-HFLS细胞的凋亡率和凋亡细胞的形态学改变;RT-PCR检测RA-HFLS细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表达水平;Western-blot检测RA-HFLS细胞中Bcl-2、 Bax、Caspase-3蛋白的表达;ELISA法检测RA-HFLS上清液中IL-6、MMP-3的含量;RT-PCR法检测RA-HFLS细胞中IL-6、MMP-3 mRNA的表达;Western-blot检测RA-HFLS细胞中Ras、p-P38、p-ERK、p-JNK、c-Jun、c-Fos、c-Myc的磷酸化水平和蛋白的表达;RT-PCR检测RA-HFLS细胞中c-Jun、c-Fos、c-Myc mRNA的转录水平。 结果: 1.LLDT-8对TNF-α诱导的RA-HFLS具有促凋亡的作用 1.1采用TUNEL法检测RA-HFLS细胞的凋亡率和凋亡细胞的形态学,结果显示:与FLS组相比,TNF-α组细胞凋亡率明显减慢(P<0.01);LLDT-8组与TNF-α组相比,细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。提示TNF-α刺激RA-FLS细胞后,能显著抑制FLS细胞的凋亡,促进细胞的增殖。且LLDT-8能显著促进TNF-α诱导的RA-HFLS细胞凋亡。 1.2采用RT-PCR检测RA-HFLS细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表达水平,结果显示:LLDT-8预处理24小时,TNF-α刺激12小时后,TNF-α组与对照组相比,Bcl-2 mRNA的表达水平显著升高(P<0.01),LLDT-8组与TNF-α组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。这表明LLDT-8能抑制Bcl-2 mRNA的表达,从而下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。但促凋亡蛋白Bax mRNA以及凋亡关键蛋白酶Caspase-3 mRNA的表达水平,各组之间无统计学差异。 1.3 Western-blot检测RA-HFLS Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达,结果显示:在TNF-α刺激15min后,各组只显示Caspase-3前蛋白的表达水平,而Caspase-3并没有被激活,以无活性的前Caspase-3形式存在。且抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表达未测出。故无法判断LLDT-8对凋亡相关蛋白的作用。 2.LLDT-8抑制TNF-α诱导的RA-HFLS的炎症作用 2.1 ELISA法检测IL-6、MMP-3的含量,结果显示:在TNF-α刺激24h后,RA-HFLS上清液IL-6、MMP-3的含量明显升高,与对照组比较,差异有显著性(P<0.01),且LLDT-8能抑制TNF-α诱导的RA-HFLS分泌的IL-6、MMP-3的含量。 2.2 RT-PCR法检测RA-HFLS中IL-6、MMP-3 mRNA的表达,结果显示:TNF-α组IL-6、MMP-3的mRNA表达水平较对照组明显增加(P<0.01),50nM LLDT-8组与TNF-α组相比,IL-6、MMP-3的mRNA表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01; P<0.05)。 3.LLDT-8对TNF-α诱导的RA-HFLS的Ras-MAPKs信号通路及其下游蛋白的调控作用 3.1 Western-blot检测RA-HFLS Ras、p-P38、p-ERK、p-JNK、c-Jun、c-Fos、c-Myc的表达,结果显示:预先使用LLDT-824小时后,TNF-α组(TNF-α刺激15min)Ras蛋白表达的条带比FLS组条带明显增强,且LLDT-8组Ras蛋白表达的条带比TNF-α组条带明显减弱。p-P38磷酸化水平,TNF-α组明显比FLS组条带增强,且LLDT-8组比TNF-α组的条带减弱。而各组之间p-ERK的磷酸化水平无明显变化。p-JNK磷酸化水平无法测出。各组之间c-Fos的蛋白表达水平无明显变化。但在c-Jun和c-Myc蛋白的表达中,TNF-α组的条带比FLS组条带明显增强,且LLDT-8组蛋白表达的条带比TNF-α组条带减弱。 3.2 RT-PCR检测RA-HFLS细胞中c-Jun、c-Fos、c-Myc mRNA的转录水平,结果显示:LLDT-8预处理24小时,TNF-α刺激12小时后,TNF-α组与对照组相比,c-Fos、c-Jun mRNA的转录水平显著升高(P<0.01),LLDT-8组与TNF-α组相比,差异有统计学意义(P<0.01),但各组之间c-Myc mRNA的转录水平无统计学差异。这表明LLDT-8能抑制细胞核内的转录因子c-Fos、c-Jun的转录水平,但不能抑制c-Myc的转录水平。 结论: 1.LLDT-8能促进TNF-α诱导的RA-HFLS细胞凋亡,且能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA的表达,从而下调Bcl-2的表达水平,但促凋亡蛋白Bax mRNA以及凋亡关键蛋白酶Caspase-3 mRNA的表达水平和Bcl-2、Bax以及Caspase-3的蛋白表达水平难以判断。 2.LLDT-8能通过抑制炎性细胞因子的产生而发挥抗炎作用。 3.LLDT-8降低p38的磷酸化和Ras的表达水平,从而抑制Ras-p38MAPK信号传导通路的异常活化。 4.LLDT-8可降低c-Jun、c-Fos、c-Myc的表达水平,从而间接抑制核内转录因子向细胞进一步分化、增殖或产生炎症,这可能是LLDT-8抑制RA滑膜的增殖,减轻滑膜炎症,抑制RA关节损伤的部分机制。