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背景原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是当今世界最常见的恶性肿瘤之一,手术仍被认为是目前最为有效的治疗手段。肝脏再生不足和缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI)是部分肝脏切除手术(Partial hepatectomy,PHx)术后面临的两大难题,多数患者由于伴有基础肝脏疾病或病变范围过大,如若手术,则术后极有可能因为肝脏再生不足而诱发急性肝衰竭,造成病人死亡。尽管白细胞介素22(Interleukin 22,IL-22)对于肝脏的保护作用及对正常小鼠单纯PHx术后肝脏再生的促进作用已被发现,目前仍缺少IL-22对伴有基础肝病的小鼠PHx术后肝脏再生作用的研究数据。另外,之前的研究者所使用的IL-22多为常规重组人白介素22蛋白(Recombinant human interleukin 22,rh-IL-22),而对于作用时间更长、分子量更大的白介素22融合蛋白(Interleukin 22 fusion protein,IL-22-FP)对肝脏保护及肝再生作用的研究甚少。为了更加真实的模拟临床病人的实际情况,进一步研究IL-22-FP对肝脏再生的作用,设计了本论文实验,探讨IL-22-FP对伴有基础肝病的小鼠PHx术后肝脏的保护作用及肝再生的促进作用,同时探究IL-22-FP对小鼠肝脏缺血再灌注(IR)损伤的保护作用,为扩大PHx手术适应症,减少手术患者术后死亡率提供数据支持。目的研究IL-22-FP对伴有基础肝病小鼠PHx术后肝脏的保护及肝再生的作用及其机制。方法1.应用刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)、四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)等化学物质制造小鼠基础肝损伤模型,在此基础上行2/3PHx手术,术前30min静脉给予IL-22-FP(125μg/kg)或者等量对照(PBS)治疗。Con A模型小鼠随机分为以下几组:1.单一Con A损伤组:Con A组;2.单一PHx手术组:PHx组;3.Con A损伤加PHx手术组:Con A+PHx组;4.Con A损伤加PHx手术加IL-22-FP治疗组:Con A+PHx+IL-22-FP组。CCl4模型小鼠同样的方法分为以下4组:1.CCl4组(单一CCl4损伤组);2.PHx组(单一PHx手术组);3.CCl4+PHx组(CCl4损伤加PHx手术组);4.CCl4+PHx+IL-22-FP组(CCl4损伤加PHx手术加IL-22-FP治疗组)。术后不同时间点(32h,40h,48h,1w)过量麻醉法处死小鼠,获取小鼠血清和肝脏组织用于后续研究。2.通过阻断小鼠部分肝叶血流(70%),90 min后恢复血流,制造小鼠肝脏IRI模型,术前30min静脉给予IL-22-FP(125μg/kg)或者等量对照(PBS)治疗,再灌注后不同时间点(6h,24h,48h)处死小鼠,获取血清和肝脏组织样本。IRI模型小鼠随机分为4组,分别为:1.假手术组:Sham组;2.单一IRI手术组:IRI组;3.IRI手术加普通白介素22(rh-IL-22)治疗组:IRI+rh-IL-22组;4.IRI手术加白介素22融合蛋白治疗组:IRI+IL-22-FP组。3.应用全自动生化分析仪测定小鼠血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平,作为衡量肝脏损伤程度的指标之一。4.取出固定于10%甲醛溶液中的部分小鼠肝脏组织,用于5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2,-deoxyuridine,Brd U)染色。染色阳性细胞即为增殖的肝细胞,通过计算Brd U阳性率(Brd U+肝细胞数/肝细胞总数)来比较不同组别小鼠肝脏再生的水平。5.部分肝组织样本用于苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色。通过染色,观察肝脏组织坏死范围、程度及炎性细胞浸润情况,用以反应肝脏损伤的程度。6.应用蛋白免疫印记技术(Western blot,WB)定量检测不同组别小鼠肝脏组织中与肝脏再生相关蛋白如增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin B1,Cyclin D1)及信号转导子及转录激活子3(Signal transducer and activator of transcription,STAT3)和p-STAT3蛋白的表达情况。结果1.在Con A模型中,低剂量(42μg/kg,Low dose group)IL-22-FP治疗组小鼠比中(125μg/kg,Middle dose group)、高(375μg/kg,High dose group)剂量IL-22-FP治疗组小鼠肝组织损伤更严重,血清ALT水平更高,Brd U阳性率更低。而中、高剂量组之间的这些差异并不明显。2.IL-22-FP能够有效减轻Con A诱导的小鼠肝组织损伤,促进Con A模型小鼠PHx后的肝再生,其机制可能与激活的p-STAT3及诱导的PCNA、Cyclin D1蛋白的表达有关同常规重组IL-22治疗组及其他手术组相比,IL-22-FP治疗组在PHx术后血清ALT及AST水平均显著降低,炎症细胞浸润及肝组织坏死程度明显减轻。术后不同时间点IL-22-FP治疗组肝指数(肝脏重量/体重,LW/BW)及Brd U阳性率均明显高于其他未治疗组和常规重组IL-22治疗组。WB结果发现,术后32h同其他组相比,IL-22-FP治疗组小鼠肝组织p-STAT3、PCNA及Cyclin D1蛋白的表达量也明显升高。3.IL-22-FP能够显著减轻CCl4导致的肝损伤,促进CCl4模型小鼠PHx术后的肝再生,并诱导肝组织中p-STAT3、Cyclin B1、Cyclin D1及PCNA蛋白的表达肝指数结果可见,术后32、40及48h,IL-22治疗组小鼠肝指数水平明显高于其他组;与肝指数类似的是,术后32、40及48h IL-22-FP治疗组Brd U阳性率也显著高于其他组,而术后1w时,各组均很难见到染色阳性细胞。WB结果显示,IL-22-FP治疗组术后肝脏组织p-STAT3、PCNA、Cyclin D1及Cyclin B1等蛋白表达量明显多于其他未治疗组,差异显著。4.IL-22FP能够有效保护肝脏,显著减轻肝脏缺血再灌注损伤在IRI小鼠模型中,IL-22-FP治疗组同rh-IL-22治疗组及其他手术组相比在再灌注后24及48h血清AST水平显著降低;HE染色切片可以看到在再灌注后48h IL-22-FP治疗组小鼠肝组织缺血坏死范围也较其他组更小。结论1.IL-22-FP能够有效保护肝脏,减轻Con A、CCl4和PHx引起的小鼠肝脏损伤。2.IL-22-FP能够显著提高Con A和CCl4模型小鼠PHx术后的肝脏再生水平。3.IL-22-FP可减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤,且效果优于rh-IL-22。4.IL-22-FP对肝脏的保护及肝再生的促进作用可能与STAT3通路的激活及其诱导的相关基因(如Cyclin D1、Cyclin B1等)的表达有关。