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实验一 P物质对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响目的:研究不同浓度及不同时间P物质对小鼠骨髓间充质干细胞ST2细胞增殖的影响,探究P物质对ST2成骨分化标记物表达的影响,探讨P物质与ST2增殖及成骨分化可能存在的浓度和时间的相关性。方法:将小鼠骨髓间充质干细胞(ST2)细胞株(吉满生物科技)接种于培养皿(中皿)中传代培养,培养基为高糖DMEM培养基(含10%FBS),放置于5%C02细胞培养箱中37℃孵育72h传代,传代至3-4代时使用。加入不同浓度(浓度为1 × 10-10,1 × 10-8,1 × 10-6,1 × 10-5 mol/L)的P物质与不加P物质的对照组一起,培养3天,分别在24h,48h,72h收获细胞,进行CCK-8检测,比较ST2细胞的增殖活性。成骨诱导培养ST2细胞,分为加入1×10-6mol/L浓度的P物质的实验组和未加P物质的对照组,在1,3,5,7天分别收获细胞进行ALP免疫荧光检测,和ALP,Col I的ELISA检测,分析ST2细胞成骨分化过程中的蛋白表达情况。结果:CCK-8检测显示在24h时除1 × 10^-6mol/L及1× 10^-8mol/L浓度组外,其他组与对照组之间对ST2细胞增殖作用无统计学差异,48h及72h时不同浓度P物质对ST2细胞增殖活性均有促进作用且有统计学差异(P<0.05),1×10^-6mol/L及1×10^-8mol/L浓度的促进作用与对照组相比有显著差异(P<0.01),其中1× 10^-6mol/L的作用效果最强;随时间变化,增殖作用增强,且各时间组间具有统计学差异(P<0.05)。ELISA检测分析结果发现ALP和ColⅠ蛋白表达水平随时间递增,且实验组大于对照组(P<0.05)。免疫荧光染色结果发现实验组ALP荧光数目较对照组多。结论:P物质能够促进ST2细胞的增殖,其中1× 10^-6及1× 10^-8mol/L促进细胞增殖活性的作用最显著,并且P物质能够在一定的条件下促进ST2的成骨分化的标记物表达上调,且具有一定的浓度和时间的相关性。实验二 P物质受体NK1在ST2细胞中的表达及与成骨分化的关系探讨目的:观察P物质受体NK1在小鼠骨髓间充质干细胞(ST2)中的表达,及其与成骨分化各标记物的关系探讨。方法:小鼠骨髓间充质干细胞(ST2)细胞株(吉满生物科技)接种于培养皿(中皿)中传代培养,培养基为高糖DMEM培养基(含10%FBS),放置于5%CO2细胞培养箱中37℃孵育72h传代,传代至3-4代时使用。加入成骨诱导培养液培养7天,分别在第1,3,5,7天收获细胞进行NK1受体的免疫细胞化学染色,测量其光密度值。同一批细胞在1,3,5,7天收获细胞培养液进行ALP、OCN(骨钙素)的ELISA检测,分析其表达量的变化。结果:细胞免疫化学显示在第1天时NK1受体即开始表达,第3,5天表达上升,一周时NK1受体明显表达,其存在于细胞膜和细胞质,主要存在于细胞质中,成骨分化标记物中成骨分化早期标记物ALP随着时间推移ELISA结果显示表达量逐渐增加,成骨分化晚期标记物OCN在1,3,5天表达量很少,第7天开始有明显增加表达。结论:NK1受体在ST2细胞成骨分化的早期即开始出现,并且与促进ST2成骨分化成熟密切相关。