【摘 要】
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目的:探讨激活巨噬细胞CD137-CD137L信号能否通过Snail介导的内皮-间质转化（EndMT）调节血管新生。方法:1.使用重组CD137L蛋白或CD137-CD137L信号阻断性抗体干预巨噬细胞CD137-CD137L信号,采用Western blot检测内皮细胞中EndMT相关蛋白和白细胞粘附分子的表达水平;2.运用细胞免疫荧光技术检测干预巨噬细胞CD137-CD137L信号后,内皮细胞
【基金项目】
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国家自然科学基金（81970379,81670405）; 江苏省社会发展基金（BE2017699）; 江苏省卫生健康委基金（H2018004）; 江苏省青年医学重点人才培养基金（QNRC2016837）; 0576）','2202','QIyqhg8I9xaeK6_Vq5fuaDEeGhXGm9Bpwb3hgHMbqIl0beBAPj_aBA==');
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目的:探讨激活巨噬细胞CD137-CD137L信号能否通过Snail介导的内皮-间质转化（EndMT）调节血管新生。方法:1.使用重组CD137L蛋白或CD137-CD137L信号阻断性抗体干预巨噬细胞CD137-CD137L信号,采用Western blot检测内皮细胞中EndMT相关蛋白和白细胞粘附分子的表达水平;2.运用细胞免疫荧光技术检测干预巨噬细胞CD137-CD137L信号后,内皮细胞中EndMT相关蛋白的表达情况;3.干预巨噬细胞CD137-CD137L信号后,利用Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽对内皮细胞肌动蛋白进行特异性染色,在荧光显微镜下观察细胞形态变化;4.干预巨噬细胞CD137-CD137L信号后,采用划痕实验和Transwell迁移实验检测内皮细胞迁移能力的变化;5.干预巨噬细胞CD137-CD137L信号后,利用Ed U-555细胞增殖检测试剂盒检测内皮细胞增殖能力的改变;6.干预巨噬细胞CD137-CD137L信号后,采用主动脉环血管新生实验和体外管腔形成实验检测血管新生能力的改变;7.转染Snail小干扰RNA干扰内皮细胞中Snail基因的表达,并筛选出干扰效果最强的细胞系。结果:1.激活CD137-CD137L信号可增强巨噬细胞诱导的EndMT:与正常培养基相比,巨噬细胞培养上清可诱导部分EndMT,即增加内皮细胞中间充质标记蛋白α-SMA和Vimentin的表达,而不影响内皮标记蛋白CD31、VE-cadherin和e NOS的表达。与之相比,CD137-CD137L信号活化的巨噬细胞培养上清除了显著上调α-SMA和Vimentin的表达外,还可导致VE-cadherin和e NOS的表达明显下调,使用抑制性CD137抗体可减弱该现象。免疫荧光实验和共培养实验结果与巨噬细胞培养上清实验结果基本一致,不同之处在于,巨噬细胞与内皮细胞共培养可明显下调内皮标记物CD31、VE-cadherin和e NOS的表达。2.激活巨噬细胞CD137-CD137L信号可促进体外血管新生:较对照组而言,CD137-CD137L信号活化的巨噬细胞培养上清可显著增强内皮细胞的增殖和迁移能力,同时,鬼笔环肽染色显示内皮细胞伸出丝状伪足并呈长梭形转变。此外,较未加刺激的巨噬细胞培养上清相比,激活CD137-CD137L信号可显著增加成管实验中管腔总长度及分支点数量,并增加离体动脉环新生微血管数目。使用CD137阻断性抗体可减弱上述促进作用。3.激活巨噬细胞CD137-CD137L信号可增加内皮细胞的炎性粘附作用:与正常培养基相比,CD137-CD137L信号活化的巨噬细胞培养上清可明显上调内皮细胞中VCAM-1和ICAM-1蛋白的表达,并增强细胞的炎性粘附率,添加CD137抑制型抗体可明显减弱该促进作用。4.激活巨噬细胞CD137-CD137L信号可上调内皮细胞中Snail蛋白的表达:蛋白免疫印迹结果显示,巨噬细胞培养上清可不同程度激活EndMT相关转录因子Slug和Twist-1的表达;与之相比,CD137-CD137L信号活化的巨噬细胞培养上清仅显著上调了Snail的表达水平,而对其他转录因子无明显影响。5.Snail si RNA可减弱CD137-CD137L诱导的EndMT及体外促血管新生效应:Western blot显示,沉默Snail可显著减弱CD137-CD137L信号诱导的EndMT;管腔形成实验显示,沉默Snail可减弱CD137-CD137L信号激活增加的管腔长度及分支数量;主动脉环血管新生实验提示,沉默Snail可减少CD137-CD137L信号激活增加的动脉环内新生微血管数量。结论:1.激活巨噬细胞CD137-CD137L信号可增强巨噬细胞上清诱导的EndMT,同时提高内皮细胞的增殖、迁移、成管和炎性粘附能力,并促进血管新生。2.转录因子Snail参与巨噬细胞CD137-CD137L信号对EndMT相关蛋白的调控,并具有促进内皮细胞增殖、迁移和血管新生的作用。
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