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目的分析造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)后T细胞免疫重建情况，了解可能影响移植效果和免疫重建的多种因素的相关关系，从而能够更加确切地评价移植后T细胞免疫重建。利用特异性T细胞受体(T cell recepter，TCR)基因转导构建EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)特异性细胞毒T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，初步探讨EBV相关移植后并发症的过继性免疫治疗。方法收集接受HSCT治疗的不同类型血液病患者的外周血标本(移植前、移植后间隔一定时间取样)，临床观察移植后并发症(如移植物抗宿主病(grait versus host disease，GVHD)、EBV相关移植后淋巴细胞增殖性疾病(Epstein-Barr virus-associated post transplant lymphoproliferative disease，EBV-PTLD)等)发生及原发病复发的情况，同时收集供者血样以及作为正常对照的正常人血样。分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMNCs)后，采用间接免疫荧光法检测CD45RA~+和CIM5RO~+细胞阳性率，提取DNA后采用实时定量PCR进行T细胞受体重排删除环(T-cell receptor rearrangement excision circles，TRECs)水平的定量检测，5例发生GVHD病例进行TCR Vα和Vβ谱系分析、T细胞克隆性分析及核苷酸序列分析。分析EBV特异性CTL克隆的TCRVα和Vβ亚家族谱系表达情况及T细胞克隆性分析，确定其优势表达的TCR Vα15和TCR Vβ1亚家族的基因序列，将TCR Vα15和TCR Vβ1基因片段分别定向克隆入真核双表达载体pIRES，构建双顺反子重组质粒TCR Vα-pIRES-TCR Vβ，再用转基因技术将其转染A549细胞株、Molt4细胞株和正常人T细胞，检测转染后特异TCR基因的表达，并进行体外细胞毒实验。结果异基因HSCT前病人的外周血TRECs平均水平为1.3673±2.1022拷贝／1000 PBMNCs，显著低于正常对照组的外周血TRECs平均水平(3.0108±0.8384拷贝／1000 PBMNCs)。异基因HSCT后早期(8周内)以CD45RO~+细胞的扩增为主，外周血TRECs水平在HSCT后4周内稍许上升，4周后明显下降，8～12周有所回升并趋于平稳，但HSCT 12周后的外周血TRECs水平仍低于移植前水平。受者HSCT前的外周血TRECs水平与HSCT后12周内的外周血TRECs水平无明显相关，供者外周血TRECs水平与HSCT后8～12周的受者外周血TRECs水平呈现正的直线相关。外周血干细胞移植组的T细胞免疫重建稍快于骨髓移植组；异基因HSCT的胸腺近期输出功能恢复较自体HSCT慢。在HSCT后1年内，有急性GVHD或慢性GVHD病史的病人的外周血TRECs水平显著降低；发生慢性GVHD病例的TCRVα和Vβ亚家族谱系的表达情况与正常对照有所不同，且多克隆表达模式发生改变，呈现寡克隆或寡克隆性增殖的趋势，出现克隆性增殖的TCR Vα亚家族分布在Vα2、3、6、10、12、14、15、25、26亚家族，出现克隆性增殖的Vβ亚家族分布在Vβ1、3、7～9、13、17、19、20亚家族；1例发生慢性GVHD病人经过治疗后外周血TRECs水平逐渐升高恢复，但是TCRVβ亚家族谱系表达在HSCT 4年后未能恢复正常模式。TRECs还可能作为HSCT相关的预后因子，外周血TRECs水平低下可能预示移植后的早期复发。酶切分析和核苷酸序列分析证实重组质粒TCR Vα-pIRES-TCR Vβ构建正确，转染重组质粒的细胞的TCR Vα15和TCR Vβ1 mRNA水平增加，可体外表达相应的蛋白；转染正常人T细胞后获得了EBV特异性CTL，具有EBV特异的细胞毒作用。结论结合T细胞亚群、T细胞谱系和胸腺近期输出功能等指标，对HSCT后的T细胞免疫重建进行监测，能够更为确切地评价移植后T细胞免疫重建，有助于适时施加免疫干预治疗，加速移植后T细胞的免疫重建。成功构建了EBV特异性CTL克隆相关的TCR Vα-pIRES-TCR Vβ双顺反子真核表达质粒，在体外实现了共表达：转染正常T细胞后获得EBV特异性CTL并证实其特异性杀伤性，为探讨EBV相关移植后并发症的新的过继性免疫治疗途径奠定了基础。