银杏(Ginkgo biloba L.),裸子植物,叶片秋季变为金黄色,是重要的园林观赏树种。此外,银杏叶片还含有多种有效成分,又是重要的经济树种。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是广泛存在的一类长度大于200个核苷酸且不具备编码蛋白功能的非编码RNA调控分子,在生长发育、育性、生物和非生物逆境响应和其他生物过程中起重要作用。lncRNA在多个层面上通过目标模仿、转录干扰、甲基化等机制调控真核生物基因表达。随着高通量测序技术发展,越来越多的植物lncRNA被鉴定,并发现在植物生长发育等方面发挥重要作用,已成为新的研究热点。然而迄今为止在裸子植物银杏中lncRNA还未有报道。本研究以银杏7个发育时期的叶片为试验材料,通过链特异性建库、双端高通量测序、基因组比对和拼接、lncRNA筛选等技术,鉴定和分析了银杏叶片中lncRNA的长度、表达量、外显子等基本特征以及靶基因功能分析。尤其进一步比较和分析了叶色转变期的差异lncRNA及其靶基因功能。主要取得结果如下:(1)将7个不同发育阶段的银杏叶片总RNA等量混合,RNA样品检测合格后,通过去除样品rRNA、反转录,第一链合成、第二链合成、末端修复,3’加A、连接接头,片段选择、含U链降解等步骤进行文库构建。文库质控合格后,利用转录组测序技术在银杏叶片中获得了 87%以上的高质量测序片段,89%以上的测序片段能够比对到参考基因组上,测序质量较高,能够反映银杏叶片转录组情况。为了预测新的lncRNA,将转录本经过长度(>200 bp)、表达量(FPKM≥0.1)、外显子(个数≥2)等基本筛选得到候选lncRNA转录本序列信息,再经过CPC(score<0)、CNCI(score<0)、CPAT(E-value<0.001)、pfam蛋白结构域分析潜在编码能力筛选(CPC、CNCI、CPAT、pfam会去掉具有潜在编码能力的转录本后得到非编码RNA),最后取其交集为高可信度lncRNA。最终在银杏叶片中获得了 1,323条lncRNA表达。(2)银杏叶片长链非编码RNA可以分为基因间长链非编码RNA,内含子长链非编码RNA,反义长链非编码RNA和正义长链非编码RNA。长链非编码RNA在947条scaffold上均有分布。和mRNA相比,长链非编码RNA序列较短、表达量较低、外显子较少,序列保守性较差。(3)通过KEGG数据库功能注释发现银杏lncRNA的靶基因可能参与了代谢作用、光合作用、激素合成等多个生物学过程。我们重点关注生长发育进程的靶基因,发现MSTRG.5250.2、MSTRG.26311.1等15个lncRNA的靶基因与类黄酮等次生代谢相关。预测到MSTRG.8532.3、MSTRG.48534.1等9个lncRNA的靶基因与光合作用相关。另外还鉴定到MSTRG.62461.1、MSTRG.35884.1等lncRNA的靶基因编码MYB等10类转录因子。(4)基于前期银杏叶片miRNA数据集,我们还预测到12个可能作为miRNA伪靶标作用的lncRNA,例如miR165靶向MSTRG.42711.1。进一步构建银杏叶片中miRNA、lncRNA和mRNA的调控网络,发现mRNA和非编码RNA共同参与基因的调控。(5)应用亚克隆技术进行序列验证,最终得到了 3个lncRNA序列与Illumina测序结果完全匹配,2个lncRNA有低于3个碱基错配,表明测序组装及lncRNA预测结果的准确性。(6)根据上面靶基因功能以及前体验证结果,我们从中挑选出8个miRNA前体序列进行荧光定量PCR实验,分析不同发育时期叶片和不同组织lncRNA的表达差异。结果显示MSTRG.58284.1在9月份叶片中表达水平较高,MSTRG.40844.1在5月份叶片中高表达,表现出lncRNA较强的组织特异性和时空表达特异性。(7)为了探明银杏lncRNAs是否对叶片转色起到调控作用。我们利用实验室已有银杏绿叶、转色期叶片以及黄叶这三个不同时期叶片转录组数据,进行测序及表达差异分析,通过去除转录本长度≤ 200 bp的转录本,表达量低于0.5的转录本,并通过编码潜能分析方法,如CPC和pfam蛋白结构域分析,取两种软件分析结果的交集,最终得到2,124条lncRNA。以绿叶为对照,我们发现绿叶和转色期叶片中共有161个差异lncRNA,其中38个lncRNA是下调表达,123个lncRNA上调表达;以及在绿叶和黄叶中共有416个差异lncRNA,其中有134个lncRNA下调,282个lncRNA上调表达。(8)对差异表达lncRNA的靶基因进行注释。差异基因GO富集在细胞过程、代谢过程及涉及单有机体的靶基因数量最多。此外,通过KEGG富集发现,以绿叶为对照,转色期和黄叶的差异基因前两个通路是代谢调控和次生代谢合成通路。综上,通过对银杏叶片中lncRNA的鉴定与分析,揭示了银杏叶片中存在较多数量的lncRNA,并且这些lncRNA参与到了银杏的生长发育、形态建成以及信号转导等进程中,这也预示了银杏叶片中可能存在着复杂的lncRNA表达调控机制。本研究提供了丰富的银杏叶片转录组和长链非编码RNA相关数据信息,为研究银杏叶片发育分子机制提供参考。