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与猪圆环病毒2型(PCV2)相关的一大类猪病统称为猪圆环病毒病(PCVD)或猪圆环病毒相关性疫病(PCVAD)。包括种猪繁殖障碍(SAMS)、断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)、生长肥育猪皮炎肾病综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)和肠炎等,同时也是猪呼吸道病综合征(PRDC)的原发病原之一,猪圆环病毒病给养猪业造成了巨大的经济损失。戊型肝炎病毒(HEV)是一种严重危害人畜健康的人畜共患病原,猪群感染猪戊型肝炎病毒常呈隐性过程,但在感染过程中可排毒污染环境,导致人戊型肝炎的发生。作者研究了江西猪群对PCV2及HEV混合感染的情况,以期为这两种病毒引起的疫病进行防控提供理论基础。
1.PCR检测江西猪群PCV2感染
参考GenBank已发表的PCV2基因序列,根据PCV2(AF027217)和PCV1(U49186)全基因序列设计合成一对引物进行PCR扩增,扩增出大小约1154bp的目的片段,建立了检测猪病料中的PCV2方法。采用该建立的PCR方法对2006年江西部分市县猪场的133份拟似病料进行PCV2检测,结果表明71份病料为PCV2阳性,阳性率为53.38%,证实江西省部分市县的猪场PCV2感染较普遍。PCV2亚型检测PCV2b阳性率为61.6%,PCV2a阳性率为4.5%,江西省猪群PCV2感染是以PCV2b为主。
2.PCV2与HEV混合感染的检测与分析
为了解PCV2型与HEV是否存在混合感染的情况,对90份病猪血清样品先进行PCV2检测,阳性58份,阳性率64.44%(58/90);对这58份PCV2阳性的血清样品再进行HEV RNA的检测,阳性6份,阳性率6.67%(6/58)。136份疑似感染病料(肾脏、脾脏、淋巴结)先进行PCV2检测,阳性124份,阳性率91.18%(124/136);再进行HEV RNA检测,阳性19份,阳性率13.97%(19/136)。结果证实PCV2与HEV存在混合感染,疑似病料混合感染率13.24%(18/136),疑似血清混合感染率6.67%(6/90),平均混合感染率10.62%(24/226)。
3.PCV2江西株的全基因序列分析
根据已发表的PCV2的全基因组序列,设计一对特异性引物,进行PCR扩增,将1个扩增产物连接到pUCm-T vector上,并克隆到大肠杆菌DH5α中,得到1个阳性克隆,经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定,证明扩增出了PCV2目的片段,本试验分离株(JXPCV2)与国内外不同地域的PCV2全基因组序列的差异很小,同源性在94.2%~99.7%;进化树分析表明JXPCV2与其他10个PCV2分离株的亲缘关系较近,与浙江分离株(AY691169)的亲缘关系最近。
4.江西省部分市县猪群HEV血清流行病学调查
为了解江西猪群HEV的感染情况,以7株(缅甸株p166Bur、墨西哥株p166Mex、美国株p166Us、中国株p166Chi、摩洛哥株p166Mor、巴基斯坦株p166Pak、新西兰株p166Nz)不同基因型的HEV ORF2(编码中和抗原表位452~617aa)基因工程表达重组蛋白的等量混合物(p166Mix)作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG二抗作为酶标抗体,确定反应最佳条件,建立间接ELISA方法。用此方法对2005年来自江西猪群的430份血清样品进行HEV IgG抗体检测,其中商品猪(>6月龄)样品380份,349份呈阳性,阳性率为91.8%;3~5月龄猪样品20份,13份呈阳性,阳性率为65.0%;小于3月龄猪样品30份,10份呈阳性,阳性率为33.3%。统计分析表明不同月龄猪HEV抗体阳性率差异极显著(P<0.01),且阳性率与猪的月龄成正相关性,不同区域的商品猪HEV抗体阳性率差异不显著(p>0.05)。
5.江西部分市县猪群HEV RNA的检测
为了解江西猪群HEV的感染情况,2005年采集江西省4个市县7个集约化猪场不同月龄猪粪样品271份,其中A猪场40份、B猪场40份、C猪场30份、D猪场43份、E猪场18份、F猪场49份和G猪场51份。利用逆转录套式PCR方法(RT-nPCR),检测HEV RNA,结果表明A猪场阳性7份,阳性率17.5%;B猪场阳性10份,阳性率25.0%;C猪场阳性7份,阳性率23.33%;D猪场阳性11份,阳性率25.58%;E猪场阳性4份,阳性率22.22%;F猪场阳性7份,阳性率14.29%;G猪场阳性4份,阳性率7.84%;总阳性50份,总阳性率为18.45%。在271份样品中,0~1月龄31份,阳性3份,阳性率9.68%;1~2月龄24份,阳性7份,阳性率29.17%;2~3月龄116份,阳性27份,阳性率23.28%;3~4月龄17份,阳性3份,阳性率17.65%;4~5月龄25份,阳性3份,阳性率12.00%;5~6月龄26份,阳性4份,阳性率15.38%;大于6月龄32份,阳性3份,阳性率9.38%。
6.江西猪群感染HEV的基因型分析
为了解江西猪群感染HEV的基因型情况,对PCR扩增产物进行纯化并测序,利用分子生物学软件进行序列分析和进化树绘制,4个江西SHEV试验株ORF2348nt同源性为92.1%~97.5%,为同一基因型,与HEV1、HEV2、HEV3同源性分别为70.7%~77.4%、72.5%~75.7%和71.6%~76.8%,与HEV4型的同源性79.2%~83.9%。5个江西SHEV试验株ORF2210nt同源性为80.1%~97.7%,为同一基因型,与HEV3同源性为78.1%~82.8%,与HEV4型的同源性78.9%~95.9%;13个江西SHEV试验株ORF2236nt同源性为80.4%~100%,为同一基因型,与HEV1、HEV2、HEV3同源性分别为68.5%~76.4%、70.6%~82.3.%和74.5%~83.7%,与HEV4型的同源性76.9%~90.8%。进化树进行分析表明22个试验毒株与HEV4型的代表株在同一分支上,属基因4型,表明江西猪群HEV感染以基因4型为主。
7.临床病例中PCV2、PRRSV、PRV和CSFV混合感染的检测与分析
根据GenBank已发表的序列和参考有关文献,分别设计合成针对猪伪狂犬病病毒(PRV)gD基因和PCV2ORF2基因的特异性引物,建立检测这两种DNA病毒的多重PCR方法,可同时扩增出217bp和404bp相应目的片段。同时,分别设计合成针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因和猪瘟病毒(CSFV) E2区基因的特异性引物,建立检测这两种RNA病毒的多重RT-PCR方法,可同时扩增出372nt和375nt相应目的片段。应用建立的两种多重PCR方法,对来自江西猪群2006年7月至2007年12月期间的253份临床病料进行检测,结果显示PRRSV阳性215份,阳性率85.0%(215/253); CSFV阳性143份,阳性率56.52%(143/253); PCV2阳性93份,阳性率36.76%(93/253);PRV阳性6份,阳性率2.37%(6/253)。PRRSV和CSFV双重感染103份,阳性率40.71%(103/253); PRRSV和PCV2双重感染53份,阳性率20.95%(53/253); PRRSV和PRV双重感染2份,阳性率0.79%; PCV2和CSFV双重感染11份,阳性率4.35%(11/253);PCV2和PRV双重感染1份,阳性率0.4%(1/253)。PRRSV、CSFV和PCV2三重感染26份,阳性率10.28%(26/253);PRRSV、PCV2和PRV三重感染1份,阳性率0.4%(1/253)。PRRSV、CSFV、PCV2和PRV四重感染1份,阳性率0.4%(1/253)。