目的急性白血病的发病机制目前尚不明确,但研究表明细胞周期调控失常、增殖异常、分化障碍、凋亡受阻等与其密切有关,并且许多因子如细胞周期蛋白及其相关抑制剂、转录因子及其相关抑制剂等参与其中,并发挥十分重要的作用。UBAP1是泛素相关蛋白家族的新成员,其结构中的UBA结构域能够介导靶蛋白与泛素蛋白非共价结合,使靶蛋白发生泛素化,进而被26S蛋白酶体降解。p16是细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂家族的一员,能够有效阻止细胞由G1期进入S期,从而发挥抑制细胞增殖的作用。UBAP1基因和p16基因同位于9号染色体p21-22,其中UBAP1基因在恶性肿瘤的研究中表达水平不一,在急性白血病中至今尚无报道；p16基因在众多恶性肿瘤组织中呈低表达,属于肿瘤抑制基因,并与急性白血病的发病密切相关。本实验主要研究UBAP1基因和p16基因在急性白血病中的表达情况及二者的相关性,将为急性白血病的病因学研究及靶基因治疗奠定重要的实验基础。方法1、收集EDTA抗凝骨髓液3-5ml,来自中国医科大学附属盛京医院血液病治疗中心2008年8月～2009年8月间门诊及住院的患者,其中初诊急性白血病患者56例作为实验组,非恶性血液病患者22例作为对照组。采用Ficoll淋巴细胞分离液提取骨髓标本中单个核细胞(MNC),生理盐水洗涤两次后,每(2-8)×106个细胞中加入1ml Trizol试剂,放入-80℃冰箱冻存。2、采用Trizol、氯仿、异丙醇和75%乙醇提取标本中总RNA,并利用DU800核酸蛋白分析仪检测RNA纯度,选取纯度在1.8～2.0之间的RNA,按照TaKaRa逆转录试剂盒说明,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术合成cDNA,-80℃冰箱冻存。3、UBAP1和p16为目的基因,GAPDH为内参照基因,引物由大连宝生物工程有限公司设计并合成,定量反应试剂盒由TaKaRa公司提供,采用SYBR Green I荧光染料实时定量PCR法进行检测。将标准品梯度稀释4-5个浓度,每个浓度分别取2μl作为模板进行扩增,通过定量分析软件构建目的基因和内参照基因的标准曲线,根据标准曲线读取样本拷贝数,最终将目的基因与内参照基因拷贝数的比值作为样本mRNA的相对量。反应结束后将扩增产物采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳紫外灯下照相观察。4、收集同期病例组样本的肝素抗凝骨髓2-3ml,采用直接法和24h培养法制备染色体,滴片、R显带、Giemsa染色,Olympus BX51显微镜下进行核型分析,根据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 2005)》描述核型。5、采用SPSS16.0统计学软件进行数据分析,p<0.05为有统计学意义。UBAP1基因和p16基因的mRNA表达水平在急性白血病各亚型及分组中比较采用Kolmogorov-Smirnov Z秩和检验(统计量用z表示),这两种基因表达水平在染色体预后分组之间的比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验,UBAP1基因和p16基因的mRNA表达水平相关性检验采用Spearman相关性分析。结果1、共收集初诊AL 58例,非恶性血液病25例,提取单个核细胞、总RNA后经DU800核酸蛋白分析仪检测,将纯度在1.8-2.0之间的RNA进行逆转录,最终获得cDNA标本78例,其中病例组56例,对照组22例。2、成功建立标准曲线(R2=0.9996,斜率为-3.29),根据标准曲线读取目的基因和内参照基因的拷贝数,通过目的基因的拷贝数／内参照基因的拷贝数得到mRNA的相对量；目的基因熔解曲线呈单峰,说明扩增产物均一,无非特异性扩增及引物二聚体；1.5%琼脂糖凝胶电泳紫外灯下观察,进一步验证扩增产物片段长度与实验设计相符。3、共收集并制备染色体标本41例,其中38例可进行核型分析,并根据SWOG标准进行预后分组。4、统计分析结果：在急性白血病中,UBAP1基因的mRNA较对照组呈高表达,p16基因的mRNA呈低表达(p<0.01)。将所有病例进行FAB分型分组比较,p16基因除成人FAB分型的M1、M2和M3外,其余组差异均有统计学意义p<0.05)；UBAP1基因,仅在成人FAB分型的M4和M5中差异有统计学意义(p<0.05)。UBAP1基因和p16基因的mRNA表达水平在SWOG染色体预后分组中差异无统计学意义(p>0.05)。UBAP1基因和P16基因表达水平在对照组中呈显著的负相关(r=-0.827,p<0.01),而在病例组中则无相关性(r=0.038,p>0.05)结论UBAP1基因高表达和p16基因低表达可能同时参与急性白血病的发病,并且UBAP1基因高表达可能主要影响AML中M4和M5亚型的发病,这一发现将为进一步探讨急性白血病的发病机制及靶向治疗提供重要的理论依据。UBAP1基因和p16基因在急性白血病中的表达异常与SWOG染色体核型预后分组无关联,说明这两种基因的表达不受遗传学改变的影响。