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在现代社会中,由于先天性异常、病毒性疾病和耳毒性药物以及老年化退行性变等,导致前庭功能障碍患者不断增多。虽然前庭功能障碍有一系列潜在的不同因素,但前庭毛细胞的缺失是前庭功能障碍最主要的原因。目前,周围性前庭功能障碍的减轻主要依靠中枢性前庭功能的代偿,而不是前庭感觉上皮本身结构和功能的恢复。因此,如果我们能够找到一种方法来有效地替代损害或缺失的毛细胞,那么就有可能使周围性前庭功能障碍患者得到更有效的治疗。许多研究已经证实,成年哺乳动物耳蜗Corti器的毛细胞缺失后不能再生,而前庭感觉上皮具有一定的毛细胞再生能力。在一些动物模型中如豚鼠、大鼠以及灰鼠等,能够诱导前庭毛细胞的再生。Math1是哺乳动物内耳毛细胞发育过程中所必需的一个基因。已有研究证实,敲除Math1基因的小鼠,听觉和前庭毛细胞均未见发育,而在体外培养的Corti器中加入以质粒为载体的Math1基因后,产生了额外的毛细胞。用Math1在人类中的同源基因Hath1,同样重复出了上述结果。近来国外有研究报道,内耳导入以腺病毒为载体的Math1（Ad-Math1）基因后,药物性前庭功能障碍的小鼠出现了前庭毛细胞的再生和功能的恢复,使通过基因导入治疗前庭功能障碍成为可能。但是目前前庭毛细胞再生研究仍存在的问题是基因导入前庭最佳途径的选择,再生毛细胞的性质、功能和来源以及与突触的连接情况尚不清楚,这些问题仍阻碍前庭功能障碍基因治疗的临床应用。本文对前庭功能障碍动物模型的建立、基因导入前庭的方法和Math1基因对药物损害后大鼠前庭感觉上皮毛细胞再生的作用等进行了研究。本研究共分为3部分:一、新霉素对大鼠前庭毛细胞毒性作用的实验研究目的:研究新霉素对大鼠前庭毛细胞的毒性作用,为药物性前庭功能障碍动物模型的建立和相关研究提供参考。方法:将15只成年Wistar大鼠分为正常对照组、新霉素组和人工外淋巴液组,新霉素组大鼠在右耳通过耳蜗底转鼓阶打孔的方法在耳蜗内注入0.1%（g/100ml）新霉素5ul,人工外淋巴液组按同样方法注入人工外淋巴液5ul。正常对照组大鼠不做任何处理。处理3天后对动物进行颈髓硬膜外短声诱发电位（click-evoked potentials on thesurface of the cervical dura mater,CDM-CEP）检查和游泳试验,来评价前庭功能,然后将动物处死,进行组织形态学观察。结果:3天后新霉素组大鼠的前庭毛细胞即出现毁灭性破坏,并出现严重的前庭功能障碍。正常对照组大鼠的游泳时间为4.0±0.71s,新霉素组大鼠的游泳时间为10.2±1.64s,人工外淋巴液组大鼠的游泳时间为4.4±1.14s。在短声（Click）刺激下,正常大鼠引出CDM-CEP的阈值为85±3.54 dB（SPL）,阈值时的潜伏期为6.59±0.41s;新霉素组大鼠120dB（SPL）仍无法引出CDM-CEP;人工外淋巴液组大鼠引出CDM-CEP的阈值为90±5.0dB（SPL）,阀值时的潜伏期为6.68±0.31s。结论:新霉素对大鼠前庭毛细胞具有毁灭性的破坏作用,新霉素耳蜗内注射的方法可以建立理想的前庭功能障碍动物模型。二、基因导入大鼠前庭的方法及Ad-Math1内耳应用的安全性研究目的:探索前庭基因导入的方法和途径,并对Ad-Math1的安全性进行研究,为前庭功能障碍基因治疗的相关研究提供参考。方法:将25只成年Wistar大鼠分为正常对照组、缺失E1、E3基因且构建有Math1基因和绿色荧光蛋白报告基因的复制缺陷型腺病毒（adnovirus-Math1-enhanced greenfluorescence protein,Ad-Math1-EGFP）鼓阶导入组和前庭阶导入组。Ad-Math1-EGFP导入组大鼠在右耳通过耳蜗底转鼓阶或前庭阶打孔的方法导入物理滴度为2.1×1011 v.p./ml的上述腺病毒（Ad-Math1-EGFP）5ul。正常对照组大鼠不做任何处理。在处理7天后对动物进行颈髓硬膜外短声诱发电位（click-evoked potentials on the surface of the cervical dura mater,CDM-CEP）和听性脑干反应（auditory brain-stem response,ABR）阈值检查和游泳试验,来评价前庭和耳蜗功能,并分别在处理后3天、7天将动物处死,进行组织学观察和形态学观察。结果:导入Ad-Math1-EGFP 3天后,Ad-Math1-EGFP前庭阶导入组的前庭终末器官及耳蜗均出现Ad-Math1-EGFP的转染;而Ad-Math1-EGFP鼓阶导入组的表达则局限于耳蜗,7天后仍未见前庭终末器官的表达;Ad-Math1-EGFP导入后,耳蜗及前庭器官的毛细胞及纤毛均未见破坏。导入7天后,正常对照大鼠的游泳时间为4.0±0.71s,Ad-Math1-EGFP鼓阶导入组大鼠的游泳时间为4.8±0.84s,前庭阶导入组大鼠的游泳时间为5.0±0.71s。在短声（Click）刺激下,正常对照组大鼠引出CDM-CEP的阈值为85±3.54 dB（SPL）,阈值时的潜伏期为6.59±0.41s,听性脑干反应（auditorybrain-stem response,ABR）阈值为37±4.47 dB（SPL）;Ad-Math1-EGFP鼓阶导入组大鼠引出CDM-CEP的阈值为91±5.48 dB（SPL）,阈值时的潜伏期为6.76±0.26s,ABR阈值为42±2.74 dB（SPL）;前庭阶导入组大鼠CDM-CEP的阈值为89±6.52 dB（SPL）,阈值时的潜伏期为6.78±0.26s,ABR阈值为40±3.54 dB（SPL）。结论:缺失E1、E3基因的复制缺陷型腺病毒对前庭和耳蜗毛细胞是比较安全的,可以作为基因导入比较理想的载体,耳蜗底转前庭阶打孔可以作为基因导入前庭的有效途径。三、Math1基因诱导成年大鼠前庭毛细胞再生的在体实验研究目的:探讨Math1基因对成年大鼠前庭毛细胞再生的作用及机制,为将来前庭功能障碍基因治疗的临床应用提供理论基础。方法:将35只成年wistar大鼠分为正常对照组、新霉素组和Math1基因导入组。新霉素组大鼠经鼓阶耳蜗内注射新霉素后,不导入Math1基因,而导入组动物经鼓阶耳蜗内注射新霉素两天后,通过前庭阶导入以缺失E1、E3基因的复制缺陷型腺病毒为载体物理滴度为2.1×1011 v.p./ml的Math1基因（Ad-Math1）5ul,正常对照组大鼠不做任何处理。处理3月后,对三组动物进行颈髓硬膜外短声诱发电位（click-evokedpotentials on the surface of the cervical dura mater,CDM-CEP）检查和游泳试验,来评价前庭功能,并分别在处理后1、2、3月处死动物,将前庭囊斑取出进行组织形态学检查分析。结果:导入Ad-Math1基因一月后,导入组大鼠前庭未见毛细胞再生,而导入Math1基因两月后,损害的大鼠前庭感觉上皮可见毛细胞再生,导入三个月时的情况与两月时相似;新霉素组大鼠在以上各个时间点均未见前庭毛细胞再生。通过透射电镜进一步检查发现再生的前庭毛细胞绝大部分为Ⅰ型毛细胞,并与传入神经纤维之间有完整的突触连接,在新生的前庭感觉上皮中,可见有丝分裂现象。处理3个月后,正常对照组大鼠的游泳时间为4.0±0.71s,新霉素组大鼠的游泳时间为11.2±1.64s,Math1基因导入组大鼠的游泳时间为10.4±1.52s。在短声（Click）刺激下,正常对照大鼠引出CDM-CEP的阈值为85±3.54 dB（SPL）,阈值时的潜伏期为6.59±0.41s;新霉素组和Math1基因导入组大鼠在120dB（SPL）仍无法引出CDM-CEP。结论:Math1基因可以诱导大鼠前庭毛细胞的再生,再生的前庭毛细胞绝大部分为Ⅰ型毛细胞,并与传入神经之间有完整的突触连接,有丝分裂参与了前庭毛细胞再生的过程。结论1.新霉素对大鼠前庭毛细胞具有毁灭性的破坏作用,新霉素耳蜗内注射的方法可以建立理想的前庭功能障碍动物模型。2.缺失E1、E3基因的复制缺陷型腺病毒对前庭和耳蜗毛细胞是安全的,可以作为基因导入比较理想的载体,耳蜗底转前庭阶打孔可以作为基因导入前庭的有效途径。3.Math1基因可以诱导大鼠前庭毛细胞的再生,再生的前庭毛细胞绝大部分为Ⅰ型毛细胞,并与传入神经之间有完整的突触连接,有丝分裂参与了前庭毛细胞再生的过程。以上研究结果表明,以缺失E1、E3基因的复制缺陷型腺病毒为载体的Math1基因（Ad-Math1）可以诱导耳毒性药物严重破坏后大鼠前庭感觉上皮的毛细胞再生,提示前庭功能障碍的基因治疗是具有可行性的。