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铁蛋白是广泛存在于动物、植物和微生物体细胞中的一类铁贮藏蛋白,具有调节生物体内铁的代谢平衡和去除亚铁离子毒性的双重作用。研究报道显示,相对于动物铁蛋白,对植物铁蛋白的研究较少,已有的研究报道显示,豆科作物将其体内多余的铁以铁蛋白的形式大量贮藏在其种子淀粉体中,因此豆科植物铁蛋白常被作为研究植物铁蛋白的理想模型。本文以鹰嘴豆为研究对象,探索并成功实现了鹰嘴豆铁蛋白的制备,并进行了鹰嘴豆铁蛋白的表征和性质研究,对鹰嘴豆铁蛋白进行了Maldi-TOF-MS和亚基测序来进行同源性分析,结合豌豆铁蛋白进行了铁还原释放和氧化沉淀的性质比较,发现鹰嘴豆铁蛋白在催化活性方面较强。并对加载不同铁离子的铁蛋白进行了动态光检测离子大小和分散程度的研究。具体研究内容和结果如下:
1、以鹰嘴豆为原料通过对提取温度、pH和加热条件的筛选,采用梯度硫酸铵盐析,经过柱层析系统纯化,得到电泳纯的鹰嘴豆铁蛋白。
2、对获得的纯蛋白进行电泳分析,得到的蛋白为含有大小为27.0kDa的一类亚基、分子量为560kDa的大分子。通过N端测序进行Blast检索,得分为47.7(P<0.01),验证了分离获得的蛋白质为铁蛋白。同时进行Western-blot分析,结果显示获得的蛋白对铁蛋白抗体具有免疫特性,进一步验证了获得的为鹰嘴豆铁蛋白。将获得的鹰嘴豆铁蛋白进行肽指纹图谱分析,发现与鹰嘴豆铁蛋白亲缘关系最近的为豌豆铁蛋白(H-2,分子量为26.5kDa)。
3、采用对铁核还原释放的原理自制的脱铁装置,对获得的铁蛋白进行脱铁处理,通过ICP-MS检测显示,脱铁铁蛋白制备成功。并对脱铁前后的光谱学特性进行了分析,紫外结果表明铁蛋白在脱铁之前没有吸收峰,而在脱铁后在280nm处具有明显的吸收峰。荧光分析结果表明,铁蛋白脱铁前没有荧光发射光谱,而在脱铁后则具有荧光发射光谱。
4、通过紫外还原释放和氧化沉淀性质分析发现,同豌豆铁蛋白相比鹰嘴豆铁蛋白具有较高的催化活性,在对鹰嘴豆铁蛋白放置于4℃和25℃条件下的稳定性分析中发现鹰嘴豆在4℃条件下放置39d才会有明显的降解,而在25℃条件下放置15d就会有明显的降解。
1、以鹰嘴豆为原料通过对提取温度、pH和加热条件的筛选,采用梯度硫酸铵盐析,经过柱层析系统纯化,得到电泳纯的鹰嘴豆铁蛋白。
2、对获得的纯蛋白进行电泳分析,得到的蛋白为含有大小为27.0kDa的一类亚基、分子量为560kDa的大分子。通过N端测序进行Blast检索,得分为47.7(P<0.01),验证了分离获得的蛋白质为铁蛋白。同时进行Western-blot分析,结果显示获得的蛋白对铁蛋白抗体具有免疫特性,进一步验证了获得的为鹰嘴豆铁蛋白。将获得的鹰嘴豆铁蛋白进行肽指纹图谱分析,发现与鹰嘴豆铁蛋白亲缘关系最近的为豌豆铁蛋白(H-2,分子量为26.5kDa)。
3、采用对铁核还原释放的原理自制的脱铁装置,对获得的铁蛋白进行脱铁处理,通过ICP-MS检测显示,脱铁铁蛋白制备成功。并对脱铁前后的光谱学特性进行了分析,紫外结果表明铁蛋白在脱铁之前没有吸收峰,而在脱铁后在280nm处具有明显的吸收峰。荧光分析结果表明,铁蛋白脱铁前没有荧光发射光谱,而在脱铁后则具有荧光发射光谱。
4、通过紫外还原释放和氧化沉淀性质分析发现,同豌豆铁蛋白相比鹰嘴豆铁蛋白具有较高的催化活性,在对鹰嘴豆铁蛋白放置于4℃和25℃条件下的稳定性分析中发现鹰嘴豆在4℃条件下放置39d才会有明显的降解,而在25℃条件下放置15d就会有明显的降解。