研究背景和目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)又称老年性痴呆,是最为常见的老年脑部神经退行性疾病,多发于65岁及以上老年人群,大约占所有痴呆病例的50.75%。其主要病理改变包括脑神经元死亡、Tau蛋白异常聚集形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTS)、神经细胞外β淀粉样蛋白(amyloid-β peptide,Aβ)聚集形成老年斑(senile plaques, SP)等。这种疾病表现为全面的认知障碍,包括：记忆、定位、判断和推理等方面的障碍。该病最终导致患者生活能力丧失,严重损害老年人的身心健康,同时也是影响家庭和社会发展的重要制约因素之一。2010年国际阿尔茨海默病协会(Alzheimer’s Association, AA)发布的数据显示,在严重危害人类健康的四大疾病——心脏病、糖尿病、脑梗死和前列腺癌的死亡率纷纷下降之时,AD的死亡率却持续上升。在美国的65岁及以上老年人群中,AD病的死亡率高居第四位。仅美国就有近530万AD患者,平均每70s就新增1例AD患者。截止到2010年,与AD有关的费用支出已经高达1720亿美元。2010年全球痴呆患者约3560万人,并以每20年翻一番的速度递增,估计到2030年,全球痴呆患者将达到6570万人。到2050年,全球痴呆患者将达到1亿1千万人以上。其中60%出现在发展中国家,且呈现逐年增加的趋势。根据2005年我国首次流行病学调查结果估计,65岁以上老年人的痴呆患病率为7.8%,其中AD患病率为4.8%,是血管性痴呆(1.1%)的4.36倍,且随着年龄增长而增加。中国是世界上人口老化基数最大的国家,随着中国人口老年化时代的到来,2006年,65岁及以上老年人口已达1.34亿。据此估计,我国的痴呆人数已近800万,其中AD近600万,到21世纪中叶,老年人口将增加到4亿,AD患者将接近2000万人。因此,中国虽然不是老年痴呆发病率最高的国家,但却是世界上痴呆人数最多且增长速度最快的国家。如何针对阿尔茨海默病采取有效的预防和治疗措施已逐渐成为我国当前医疗保健服务体系和经济社会发展中急需解决的重大问题。尽管目前AD的发病机制还不完全清楚,但随着人们对AD研究的深入,星形胶质细胞(astrocyte, AS)在AD的病理改变中起到的作用引起越来越多的关注。大多数学者认为Aβ沉积激活AS引起的炎症反应、氧化应激是AD的重要病理机制。胶质细胞是神经系统内数量众多的一大类细胞,约占中枢神经系统细胞总数的90%,其中,AS是胶质细胞的重要组成部分,几乎包括了胶质细胞的所有功能。既往认为,中枢神经系统内信息传递与整合是由神经元网络完成的,星形胶质细胞仅是被动的辅助角色,起到支持、提供营养以及协助代谢等作用。近年随着膜片钳及分子生物学技术的进步,人们发现AS在维持神经元内外环境、生存、迁移、免疫调节、信号转导、轴突生长及功能整合等方面都具有重要作用,对神经元生存起到重要作用,与中枢神经系统(CNS)疾病密切相关。阿尔茨海默病的关键性特征之一是脑内炎症,炎症过程是由星形胶质细胞和小胶质细胞释放的细胞因子所介导,并参与免疫反应。炎症是Aβ沉积引起的继发性反应,也是导致神经元退行性变的重要因素。Aβ蛋白的病理性沉积能够激活星形胶质细胞,并高度表达星形胶质细胞特征性蛋白——胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)。过度活化的星形胶质细胞和小胶质细胞释放大量炎性介质(例如IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1等),继而将诱导型一氧化氮酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)激活,产生一氧化氮(nitric oxide, NO)及活性氧簇(reactive oxygen species, ROS),后者又可以与活性氮簇(reactive nitrogen species, RNS)作用,生成过氧化硝酸盐。这种过氧化物能对细胞产生很强的毒性,引发细胞凋亡。此外,小胶质细胞和星形胶质细胞的相互作用还会进一步增加炎症因子前体、补体以及氧化物的产生。这些炎症介质和氧化物的产生会导致Ap的进一步聚积,从而将细胞内炎症因子介导的级联反应进一步扩大,使之进入恶性循环。因此,抑制由过度活化的星形胶质细胞导致的神经炎症反应有可能对抑制AD病的发生发展起到重要作用。但是关于AD的病因及发病机制至今尚未完全明确,因此目前尚无特效治疗药物。要更有效地降低AD的发病率,必须抓好疾病防治的一级预防措施：如在食品中添加有效预防AD的食品添加剂也可能是一种低成本、有意义的预防AD的好办法。白藜芦醇(trans-resveratrol,Res),可能是一种较理想的食品添加剂,美、日等国家已经使用。其作为一种抗氧化、抗诱变和抗感染活性成分,有明显的抗炎、抗衰老、抗癌症和抗心脑血管疾病的作用。其化学名3,5,4’-三羟基反式芪(3,5,4’-trihydroxystilbene),一般为反式白藜芦醇,它常与顺式异构体(cis-resveratrol)及白藜芦醇甙(resveratrol glucoside)共同存在于葡萄、桑葚、花生等植物和食品中,尤其在红葡萄酒中的含量较高。由于白藜芦醇及其衍生物具有抗菌、抗氧化、抗血栓、肿瘤等诸多的生理活性,在食品、医药、植物生理等领域受到国内外专家的广泛关注。目前研究表明,白藜芦醇能有效的对抗中枢神经缺血损伤,保护缺血区神经元,减少梗死范围,降低缺血再灌注所造成的迟发性神经细胞的凋亡,改善脑缺血引起的肢体运动功能障碍。白藜芦醇对神经系统的保护作用已有较多研究,但目前的研究主要集中在神经元上,对于星形胶质细胞的影响少见报道。本研究通过检测不同浓度白藜芦醇对于炎症损伤状态下星形胶质细胞炎症递质释放的影响,探索白藜芦醇对神经损伤的保护作用。为AD的预防探索新的可能途径。本研究运用一种新型、稳定的星型胶质细胞体外培养技术,并成功复制了由炎症引起的星形胶质细胞损伤。通过对比损伤前后星形胶质细胞炎症递质的释放以及炎症损伤对于NO/iNOS信号系统表达的影响,并检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogmase,LDH)的漏出量,了解白藜芦醇对于损伤状态下对星形胶质细胞的影响。为白藜芦醇对抗中枢神经损伤以及减缓AD症状发展的一级预防措施提供新的实验依据。白藜芦醇的抗衰老活性和神经保护作用为开发和研制更多的白藜芦醇抗AD药品以及保健品提供新的思路。目前市场销售的白藜芦醇多是从天然植物中提取的,但植物提取技术面临成本高,得率低和植物资源有限等问题。所以人们尝试开发新的白藜芦醇合成途径。目前研究发现白藜芦醇的合成途径包括：化学合成和生物合成。化学合成的优点在于选择性高,但由于成本高、使用的催化剂价格昂贵且毒性大,所以不适合用于工业化生产,目前仅处于实验室研究阶段。近几年人们的目光已经从化学合成转向生物合成。本实验室以往研究初步尝试并成功建立了一种白藜芦醇植物生物合成的方法,即在实验室无菌环境下培育高产根系的花生,并对花生根系进行诱导,使之能够大量、稳定的生产含白藜芦醇的混合提取物,建立了从花生发芽到产生白藜芦醇的一整套实验室生物合成方案。然而,花生根诱导提取物对细胞活性的影响如何、是否具有抗炎保护效应、与白藜芦醇纯品相比,其效应大小如何；这些都是本文要研究的重点问题。因此,本研究通过在实验室以往研究建立的合成方案基础之上,优化混合物的提取工艺。进一步对比研究花生根诱导提取物与白藜芦醇纯品分别对脂多糖损伤下星形胶质细胞的抗炎保护作用。研究思路一、优化改进星型胶质细胞体外培养方法及AD炎症细胞实验模型的建立运用微孔滤膜过滤的方法,纯化乳鼠大脑皮质星形胶质细胞,替代传统的差速贴壁方法纯化星型胶质细胞的方法,降低了实验操作难度。之后通过GFAP免疫组化法鉴定乳鼠大脑皮质星形胶质细胞的纯度,采用不同浓度脂多糖LPS(lipopolysaccharide)对细胞进行不同时长的损伤,CCK-8法检测细胞存活率二、白藜芦醇对星形胶质细胞的保护作用给予不同浓度白藜芦醇(5、25、50μmol/L)预处理后,进行LPS损伤24h,Griess法检测NO释放量,Elisa法检测TNF-a表达量及Western blot法检测iNOS蛋白的表达水平。通过检测NO、TNF-a了解白藜芦醇对损伤后星形胶质细胞炎症因子释放的情况；通过检测iNOS蛋白的表达水平以及LDH的漏出量,了解白藜芦醇对LPS引起星形胶质细胞损伤的保护作用以及这种保护作用是否与iNOS/NO的表达通路有关。三、无土栽培高产花生根系诱导白藜芦醇采用本实验室已经筛选出的无土栽培高产花生根系培养基进行花生根培养,利用含有生物诱导子的诱导培养基对花生根进行诱导。收集诱导培养基,乙酸乙酯对培养基行进液相萃取,对乳化层采用超声破乳等技术,进一步萃取。收集萃取液进行负压干燥,备用。通过薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)对诱导培养基提取物中白藜芦醇进行定性、定量分析,测定诱导至培养基中的白藜芦醇含量。四、花生根提取物对星形胶质细胞的保护作用给予不同浓度花生根提取物预处理后,炎症损伤星形胶质细胞。通过检测NO、TNF-a了解白藜芦醇对损伤后星形胶质细胞炎症因子释放的情况。并通过检测星型胶质细胞特征性蛋白GFAP,了解星形胶质细胞活化的情况。最后通过检测LDH的漏出量,了解花生根提取物对LPS引起星形胶质细胞损伤的保护作用。结果一、星型胶质细胞炎症损伤实验模型的建立运用微孔滤膜过滤的方法改进对乳鼠大脑皮质星形胶质细胞的纯化操作,通过GFAP免疫组化染色鉴定,培养的星形胶质细胞纯度>95%。采用不同浓度LPS对细胞进行损伤,细胞处理一定时间后,随着LPS浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,差异具有统计学意义(P<0.05)；在同一LPS浓度水平时,细胞的存活率则随着损伤时间的延长而下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中1μg/ml LPS处理24h实验组,细胞存活率最接近50%,有利于后续试验中观察白藜芦醇是否具有保护作用,亦或是加剧损伤等。因此,本次实验选用1μg/mlLPS处理24h作为细胞损伤的条件。二、白藜芦醇对星形胶质细胞的保护作用(1)细胞存活率：LPS损伤星形胶质细胞后,细胞存活率急剧下降至51.04%,三组不同浓度(5、25、50μ mol)的白藜芦醇预处理细胞后,细胞存活率分别为58.72%、76.38%、90.42%,呈浓度剂量关系递增。(2)LDH漏出量：收集上清液检测LDH漏出,结果显示,LPS损伤可导致细胞LDH漏出量增加(P<0.05)；与LPS处理组相比,5、25、50μ mol/L白藜芦醇预处理组细胞LDH漏出量均减少(P<0.05),但尤以高浓度RES(50μmol/L)处理组,LDH漏出量减少最为明显,提示高浓度RES对AS的保护作用较强。(3)TNF-a表达水平：ELISA检测结果显示,LPS处理组细胞的TNF-a释放量明显上升；与LPS处理组相比,25,50μmol/L RES处理组细胞的释放量均有下降(P<0.05),但5μmol/L RES处理组细胞TNF-a释放量与LPS处理组细胞并无显著性差异(P>0.05)。其中,以50μmol/L RES处理组TNF-a释放量下降最为明显。提示,高浓度RES对星型胶质细胞TNF-a释放量有较明显抑制作用。(4)NO表达水平：LPS处理24h后,NO释放量明显上升(P<0.05)；与LPS处理组相比,25、50μmol/L RES处理组细胞NO释放量明显减少(P<0.05),而5μmol/L RES对处理组细胞NO释放量无明显影响,与LPS处理组细胞并无显著性差异(P>0.05),提示高浓度RES对星型胶质细胞NO释放具有抑制作用。(5) iNOS表达量：Western blot法分析结果显示,阴性对照组细胞的iNOS蛋白的表达水平很低,LPS处理组iNOS蛋白的表达量与阴性对照组相比明显上升；与LPS处理组相比：5、25、50μmol/L RES预处理组iNOS蛋白表达量均下降。尤其以50μmol/L RES处理组iNOS表达量下降明显。提示LPS诱导的NO释放与iNOS蛋白表达的上调有关,且高浓度RES对iNOS/NO通路有明显抑制作用。三、无土栽培高产花生根系诱导白藜芦醇利用生物诱导子等活性成分,对高产花生根系进行诱导。薄层色谱法鉴定诱导前白藜芦醇呈阴性、诱导后白藜芦醇显示阳性；高效液相色谱法(HPLC)定量结果,白藜芦醇含量为564.457μ g/g DW,而野生花生根白藜芦醇含量为51.23μg/g DW,转基因番茄和转基因莴苣白藜芦醇含量分别为53μg/g DW,56.40μg/g DW。四、花生根粗提物对星形胶质细胞的保护作用(1)粗提物无毒浓度筛选：cck-8法测定细胞存活率结果显示：与正常对照组相比,粗提物浓度在10-2g/L及其更低浓度之后,细胞存活率没有显著性差异(P<0.05)。因此,本实验最终选取10-2g/L、10-3g/L、10-4g/L三个浓度粗体进行后续的细胞保护作用研究。(2)LDH漏出量：不同浓度粗提物(10-2g/L、10-3g/L、10-4g/L)预处理细胞,采用LPS损伤细胞,之后检测LDH漏出量。结果显示：LPS损伤可导致细胞LDH漏出量增加(P<0.05)。与LPS处理组相比,三组浓度粗提物LDH漏出量均较LPS组有所减少(P<0.05),且浓度越高,LDH漏出量越少,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。提示粗提物对细胞膜完整性起到了一定的保护作用。(3)TNF-α表达水平：ELISA检测结果显示,LPS处理组细胞的TNF-α释放明显上升；与LPS处理组相比,10-2g/L、10-3g/L粗提物浓度处理组细胞TNF-α表达量较LPS处理组降低(P<0.05),10-4g/L浓度组与LPS处理组差异无统计学意义(P>0.05)提示：10-2g/L、10-3g/L浓度的粗提物对星形胶质细胞的炎症损伤具有一定的保护作用。结论1、成功利用LPS诱导星形胶质细胞产生炎症损伤效应；2、LPS诱导炎症损伤能够增加星形胶质细胞神经递质的释放包括TNF-α和NO,并且能够增加星型胶质细胞iNOS的表达和LDH漏出量。5-50umol/L的白藜芦醇对LPS诱导的星型胶质细胞炎症损伤具有保护作用,且这种作用呈现一定的浓度-效应关系。3、成功利用实验室无土培养的花生高产根系培养方案培养出高产根系,并诱导白藜芦醇含量达564.457μ g/g DW；4、10-2g/L、10-3g/L浓度的粗提物对LPS所致的星形胶质细胞的炎症损伤具有保护作用。