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造血微环境(Hematopoietic microenvironment,HM)参与造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)的维持、自我更新和定向分化,骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell,BMSCs)是造血微环境中最核心的成分,通过与造血细胞直接接触、分泌造血调控因子、合成细胞外基质,调控造血干细胞的自我更新、增殖与分化。文献证实大量化疗药物对骨髓会产生毒副作用,其中骨髓基质细胞损伤是化疗主要副反应——骨髓抑制的主要原因之一。化疗对骨髓基质细胞的损伤作用呈剂量依赖性,即便常规剂量化疗药物也可导致骨髓基质细胞死亡,从而诱发骨髓抑制、造血功能减退造血重建障碍以及药物抗性。课题组前期实验表明,化疗药物5-氟尿嘧啶可导致骨髓基质细胞氧化损伤、分泌生物活性物质改变,从而诱发造血细胞氧化应激性早衰,但5-FU损伤骨髓基质细胞的具体机制尚不明确,探讨其相关机制对于减轻化疗药物的毒副作用以及筛选化疗时骨髓保护药物有重要科学理论价值和临床指导意义。近年来研究发现,Wnt/β-catenin信号通路可以广泛影响骨髓基质细胞功能,参与骨髓基质细胞增殖、氧化应激调控,并通过基质依赖的方式调控造血干细胞自我更新。当归是中医临床“补血、活血”药物,当归多糖(Angelica sinensis Polysaccharides,ASP)作为当归药效主要成分之一,具有抗氧化、促造血、延缓造血干细胞及骨髓基质细胞衰老等作用。课题组前期工作证实ASP可通过减轻5-FU对骨髓基质细胞的氧化损伤而延缓造血细胞氧化应激性早衰。但ASP保护骨髓基质细胞的具体调控分子机制尚不清楚,有待深入研究。因此本研究着重探讨5-FU损伤骨髓基质细胞机制是否与Wnt/β-catenin信号有关,ASP保护骨髓基质细胞的机制是否与调控Wnt/β-catenin信号有关。课题以人骨髓来源基质细胞株HS-5为研究对象,探讨5-FU抑制骨髓基质细胞增殖与Wnt/β-catenin信号的关系及其可能的作用机制;ASP减轻5-FU对骨髓基质细胞的损伤、保护骨髓基质细胞增殖与调控Wnt/β-catenin信号的关系,旨在阐明化疗药物损伤骨髓基质细胞的可能机制,为防治化疗副反应提供新的治疗靶点,为保护骨髓预防化疗损伤的药物筛选提供新的策略。方法1.观察5-FU对人骨髓基质细胞HS-5生长的影响:体外培养HS-5细胞,加入加入12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL不同浓度5-FU,CCK-8检测HS-5细胞抑制率。2.观察ASP对5-FU作用后的HS-5细胞生长的影响及其与Wnt信号的关系:以Wnt通路激动剂LiCl设置阳性对照,实验分为对照组、5-FU组、5-FU+ASP组和5-FU+LiCl组。对照组:常规培养;5-FU组:常规培养基础上加入25μg/mL 5-FU;5-FU+ASP组:常规培养基础上加入浓度为100μg/mL的ASP预处理细胞,6h后加入25μg/mL5-FU。5-FU+LiCl组:常规培养基础上加入浓度为10mmol/L的LiCl预处理细胞,6h后加入25μg/mL 5-FU。每组均培养48h。EdU检测细胞增殖活力。以Wnt通路拮抗剂Dkk1设置阴性对照,实验分组:对照组;5-FU组;Dkk1组:常规培养基础上加入浓度为50 ng/mL Dkk1培养48h;ASP+5-FU组;Dkk1+ASP+5-FU组:常规培养基础上加入浓度为50 ng/mL Dkk1预处理细胞,1h后加入100μg/mL的ASP,6h后加入25μg/mL 5-FU。CCK-8检测细胞存活率。3.探讨ASP对5-FU作用后的HS-5细胞内Wnt/β-catenin通路相关信号蛋白表达的影响:实验分组同上,分为对照组、5-FU组、5-FU+ASP组和5-FU+LiCl组。免疫荧光检测通路关键效应蛋白β-catenin的表达,Western Blot检测β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、Lef-1、Cyclin D1及C-myc蛋白表达。4.观察ASP对5-FU作用后的HS-5细胞氧化应激的影响:实验分为对照组、5-FU组、5-FU+ASP组和5-FU+LiCl组,同上。DCFH-DA荧光检测细胞活性氧(ROS)含量,TBA法检测细胞丙二醛(MDA)含量,WST-1法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,可见光法检测过氧化氢酶(CAT)活性。5.探讨ASP对5-FU作用后HS-5细胞内氧化应激转录因子FoxO1以及下游靶基因的影响:实验分为对照组、5-FU组、5-FU+ASP组和5-FU+LiCl组,同上。Western Blot检测FoxO1、p-FoxO1、P27 Kip1、Bim、Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达。6.探讨ASP对5-FU作用后HS-5细胞损伤的影响:实验分为对照组、5-FU组、5-FU+ASP组和5-FU+LiCl组,同上。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。衰老特异性β-半乳糖苷酶检测细胞衰老。结果1.5-FU抑制骨髓基质细胞生长,呈时间剂量依赖性。25μg/mL5-FU作用48h可抑制半数左右细胞增殖,以此浓度时间进行后续实验。2.EdU结果显示,5-FU作用骨髓基质细胞后增殖细胞比例显著低于对照组;而经ASP预处理后增殖细胞比例较5-FU组显著上升。CCK-8结果表明5-FU作用后HS-5细胞存活率显著下降;与5-FU组相比,预处理ASP可部分逆转5-FU诱导的细胞存活率降低,Wnt通路抑制剂Dkk1可拮抗ASP对骨髓基质细胞的保护作用。3.免疫荧光结果显示,5-FU作用后骨髓基质细胞β-catenin总蛋白表达明显降低,同时细胞核内蛋白表达显著下降。经ASP预处理,可使细胞内β-catenin总蛋白表达上升,蛋白核转位显著回升。Western Blot实验结果表明,与对照组相比,5-FU组Wnt/β-catenin信号通路GSK-3β总蛋白水平不变,p-GSK-3β、总β-catenin、核内β-catenin、Lef-1、Cyclin D1及C-myc蛋白表达水平下调。经ASP预处理的细胞Wnt/β-catenin信号通路GSK-3β总蛋白水平不变,p-GSK-3β、总β-catenin、核内β-catenin、Lef-1、Cyclin D1及C-myc蛋白表达水平较5-FU组相比有显著性上升。4.5-FU削弱骨髓基质细胞抗氧化能力,SOD、CAT活性降低,胞内ROS和MDA含量升高,细胞氧化应激增强。ASP预处理细胞后,与5-FU组相比细胞抗氧化能力增强,SOD、CAT活性增强;ASP减轻5-FU导致的细胞氧化应激,胞内ROS和MDA含量显著性下降。5.Western Blot实验结果表明,与对照组相比5-FU组骨髓基质细胞内FoxO1、P27 Kip1、Bim、Bax和caspase-3蛋白表达水平升高,p-FoxO1和Bcl-2蛋白表达水平降低。ASP预处理可下调5-FU作用后细胞内FoxO1活性,P27 Kip1、Bim、Bax和caspase-3蛋白表达显著性降低,p-FoxO1和Bcl-2蛋白表达显著性升高。6.流式细胞术结果显示与对照组相比,5-FU作用骨髓基质细胞后凋亡细胞比例增加,细胞周期阻滞在G1期,衰老细胞比例显著上升。ASP预处理可显著降低5-FU作用后凋亡和衰老细胞比例。结论1.5-FU通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制骨髓基质细胞增殖。2.5-FU诱发骨髓基质细胞氧化应激,活化氧化应激转录因子FoxO1,导致细胞氧化损伤,发生凋亡或衰老。3.ASP可通过激活Wnt/β-catenin信号通路,减轻5-FU所致骨髓基质细胞增殖抑制。4.ASP通过直接拮抗氧化应激或间接激活Wnt/β-catenin信号下调FoxO1,从而减少5-FU诱导的细胞凋亡,恢复细胞周期,抑制细胞衰老。