基础和流行病学研究证实,糖代谢异常[包括糖尿病、空腹血糖受损(impaired fasting glucose, IFG)和糖耐量减低(impaired glucose tolerance, IGT)]与缺血缺氧性脑损伤之间存在着密切的内在联系。葡萄糖作为脑组织最重要的能量来源,其水平过高或过低都会影响神经功能、造成不同程度的脑损伤。低血糖与高血糖均是脑梗死的重要危险因素,两者在脑梗死防治中具有同等的重要性。控制血糖水平波动对减轻脑缺血再灌注引起的损伤具有一定的意义。急性脑缺血可诱导脑内神经干细胞增殖、分化现象,促进自我修复,但其增殖数量上的不足致使自我修复功能受限。已有研究表明,血糖水平是限制缺氧后神经干细胞存活和自我更新能力的关键因素。血糖水平波动是否影响缺血缺氧环境下神经干细胞的存活和增殖能力,进而限制了其对神经损伤的自我修复功能?目前,相关研究还不多见。既往研究大都集中在持续性高浓度葡萄糖对神经干细胞的存活、增殖及凋亡的影响研究,并认为一定浓度的高糖对神经干细胞缺血缺氧损伤具有保护作用。但是在实际临床实践中,急性脑卒中患者病程的进展过程极不稳定,患者体内血糖容易出现频繁的波动改变,数值差距变化浮动大,所以以往的研究模式不能完全客观真实地反映糖尿病患者体内由于血糖的不断变化而对神经干细胞产生的损伤效应。因此,本实验用成年大鼠神经干细胞在体外建立缺血缺氧损伤模型,并模拟脑梗死患者缺血后出现的血糖波动现象,采用免疫荧光细胞化学染色、流式细胞术和Western blot等技术方法观察波动性与持续性高浓度葡萄糖对缺血缺氧条件下培养后的神经干细胞存活、增殖能力和MAPK信号通路的的影响,从而从另外一个角度探索波动性高血糖加重缺血性脑损伤的病理机制,进而为临床上脑缺血患者急性期血糖控制提供一定的参考。第一部分成年大鼠神经干细胞体外缺血缺氧损伤模型的建立目的：探讨一种简便、稳定、可重复的大鼠成年神经干细胞体外缺血缺氧损伤模型制备方法。方法：1、细胞来源：采用来自于成年Fisher344大鼠的海马神经干细胞系(ANSCs)为研究对象,无血清培养基培养并传代,用巢蛋白(Nestin)和DAPI免疫荧光双染技术检测其神经干细胞生物学特性。2、建立体外神经干细胞缺血缺氧损伤模型的方法：三气培养箱物理缺氧、无糖Earle’s平衡盐溶液缺糖相结合的方法,即将三气培养箱氧气浓度调至1%,制备缺氧环境,将培养基换为不含葡萄糖的Earle’s培养基,分别缺氧2h,4h,6h,8h,10h后取出细胞,更换为正常神经干细胞基础培养基,恢复正常条件继续培养,同时设置常氧常糖正常对照。3、细胞形态学、活力及凋亡改变检测：缺氧缺糖2-10h不等时间后,恢复正常条件继续复氧培养24h,观察细胞形态学、细胞活力以及细胞凋亡率改变：倒置显微镜下观察各组细胞形态变化；CCK-8比色法测定细胞活力变化；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定细胞凋亡率。比较不同缺氧时间对细胞的损伤程度,确定适合神经干细胞的合适缺氧缺糖时间。结果：1、培养体系中的细胞94%以上呈Nestin强阳着色,说明其94%以上细胞均处于原始未分化状态,并具有增殖能力,可用于后续实验。2、缺糖缺氧2h时,神经干细胞活力未见下降反而存活率有一定的增加。但随着缺氧缺糖时间延长,细胞存活率逐渐下降,凋亡率逐渐增高,且缺氧缺糖6h起细胞结构完整性开始受到破坏,细胞存活率较正常对照组显著下降,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1、采用三气培养箱物理缺氧、无糖Earle’s平衡盐溶液缺糖相结合的方法可成功建立一种简便、有效的神经干细胞体外缺血缺氧损伤模型。2、缺氧缺糖6小时可能是成年神经干细胞体外氧糖／剥夺模型的合适时间,该模型可用于神经干细胞缺血缺氧损伤的体外实验后续研究。第二部分波动性高糖对成年大鼠神经干细胞缺血缺氧损伤的影响目的：观察波动性与持续性高浓度葡萄糖对缺血缺氧条件下培养后的神经干细胞存活、增殖能力的影响。方法：1、建立神经干细胞体外缺血缺氧损伤模型：采用三气培养箱物理缺氧、无糖Earle’s平衡盐溶液缺糖相结合的方法造成神经干细胞缺血缺氧损伤。2、实验分组：缺氧后以17.5mmol/1(对照组)、27.75mmo1/1(持续高糖H1组)、41.75mmol/1(持续高糖H2组)及17.5/41.75mmol/1(波动性高糖组,白天三小时高糖两小时正常浓度葡萄糖波动三次,高糖过夜)四种不同浓度的葡萄糖进行复氧培养。为排除渗透压对细胞活性的影响,用甘露醇作为渗透压对照,用CCK-8法对其处理后24h的ANSCs细胞活性进行了检测。3、神经干细胞活力及增殖检测：在复氧培养后12h、24h、48h三个时间点对成年神经干细胞的活力、增殖情况进行了比较：倒置显微镜下观察各组细胞形态变化；CCK-8比色法测定细胞活力变化；EdU标记法测定细胞增殖变化；PI染色流式细胞术检测细胞周期。结果：1、CCK-8比色法计量神经干细胞活力显示：各组在48h内吸光度值逐渐增高,差异有统计学意义(P<0.05)。其中,12h时持续高糖H1组吸光度值显著高于其他各组。但随着时间的延长,各组细胞吸光度值较对照组均显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)。在各个时间段内,波动性高糖组细胞光密度值均显著低于其他三组(P<0.01)。2、而渗透压对照实验显示,甘露醇对照组与葡萄糖对照组间的细胞活性均无显著性差异(P>0.05),这提示持续高糖组与波动性高糖组的细胞活性下降并非渗透压所致。3、EdU标记法对细胞进行增殖分析：持续高糖H1组EdU阳性细胞率为37.28±6.56%,与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05)。而持续高糖H2组、波动性高糖组EdU阳性细胞率分别下降至26.86±5.19%、20.33±5.25%,两者与对照组比较,差异均具有显著性意义(P<0.01)。4、流式细胞术检测提示：在持续高糖和波动性高糖环境下培养的神经干细胞,其G0/G1期细胞百分数增多,S期细胞百分数减少；反映增殖活性的两个参数PI和SPF,均较对照组显著下降。结论：1、缺血缺氧后及时恢复供应葡萄糖,对神经干细胞的缺血缺氧损伤可能有一定的保护作用。2、缺血缺氧早期,轻度升高的葡萄糖对神经干细胞的具有一定保护作用。缺血缺氧后期,持续性高糖和波动性高糖则降低了成年神经干细胞代谢和增殖活性,加重了缺血缺氧性损伤。3、波动性高糖比持续性高糖更显著地抑制了神经干细胞的活性。4、持续高糖和波动性高糖通过阻滞神经干细胞于Gl/S转变期,而抑制了细胞增殖。第三部分波动性高糖对缺氧后成年大鼠神经干细胞MAPK信号通路的影响目的：初步探讨葡萄糖波动对缺氧后成年大鼠神经干细胞MAPK信号通路的激活情况。方法：1、神经干细胞缺血缺氧损伤模型的制备：采用三气培养箱物理缺氧、无糖Earle’s平衡盐溶液缺糖相结合的方法造成神经干细胞缺血缺氧损伤。2、细胞分组及处理：缺氧缺糖6h后,更换为含有不同浓度葡萄糖的培养基继续培养,在24h后Western blot法检测MAPK信号通路ERK、JNK及P38蛋白激活情况,每一时间点重复3次。结果：1、缺血缺氧后各组神经干细胞均表达ERK1/2、JNK和p38蛋白,各组间差异无统计学意义。2、各组神经干细胞PERK1/2表达较正常组下降,且随着浓度的升高其表达量进一步下降,且波动性高糖下复氧培养的神经干细胞PERK1/2表达量较其他各组均显著下降,差异有统计学意义。PERK1/2的变化趋势与细胞增殖变化一致。3、在持续性高糖和波动性高糖环境培养下的神经干细胞JNK和p38MAPK蛋白的磷酸化水平均相应显著增加。结论：持续性高糖和波动性高糖环境培养下的神经干细胞,活性及增殖能力显著下降,可能与JNK/P38MAPK通路的持续激活和ERK通路的同步抑制有关。