前言脑血管病(Cerebral vascular diseases，CVD)是当前的常见病和多发病，其中脑出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)以其高病死率和高致残率成为严重威胁人类生命健康的重症疾病之一。脑出血后最重要的病理改变是血肿本身及其周围继发性损害，脑出血后血肿周围组织会在短期内因血肿的机械压迫，局部血流量减少，血液成分及各种细胞毒性物质的释放而发生细胞凋亡。进一步研究脑出血后细胞凋亡的规律和如何早期抑制细胞凋亡以促进神经功能的恢复对指导临床治疗有重要意义。本实验采用Ⅳ型胶原酶注入建立脑出血动物模型，TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)及凋亡相关蛋白的检测探讨实验性脑出血血肿周边组织的凋亡损伤，并分析脑出血后TUNEL阳性细胞、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的时相变化规律，以及凋亡传导信号Cytc、Fas的时程变化，并在早期实施大鼠脑内立体定向血肿抽吸，减少血肿压迫，通过探讨治疗前后脑出血灶周围脑组织中细胞凋亡的变化规律，进一步评价立体定向血肿抽吸术对脑出血后后遗症期的神经功能恢复是否有益，为血肿抽吸术的临床评价提供一定理论参考。第一部分实验性脑出血抽吸术的建立与评估目的脑出血(Intracerebral hemorrhage ICH)是指血液直接破人脑实质。脑出血是一种常见的疾病。在所有收入院的卒中病人中脑出血患者占10～30％，而且其致残率和死亡率非常高，有统计显示ICH6个月的死亡率为30-50％，只有20％的患者6个月能恢复自理能力。随着人口老龄化，脑出血的发病率会随之增加。在治疗上目前仍无特效的方法。上个世纪80年代出现的立体定向血肿抽吸术，作为一种极具潜力的治疗手段，20年当中其得到了极大的发展。但是其基础研究确少见报导，主要的原因就是缺乏理想的动物模型。在实验性脑出血模型基础上建立一种简单经济、重复性好、能模拟临床过程的立体定向血肿抽吸术并对其效果进行评估，可为进一步研究早期立体定向血肿清除术后脑组织的病理生理变化提供理想的方法。实验材料与方法66只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重180-220g，月龄3～5月)随机分为4组：正常组(n=12只)、假手术组(n=18只)、脑出血对照组(n=18只)、脑出血后血肿抽吸组(n=18只)。脑出血对照组将Ⅳ型胶原酶注入SD大鼠尾状核诱导形成脑出血后对其不进形任何处置。假手术组过程同脑出血对照组只是不向大鼠脑内注射胶原酶，脑出血后血肿抽吸组将Ⅳ型胶原酶注人SD大鼠尾状核诱导形成脑出血10个h后向血肿腔内注入尿激酶溶解血凝块，实施血肿抽吸术排出脑内血肿。通过t检验对血肿抽吸组与未抽吸组及假手术组之间脑血肿体积、脑组织含水量的测定及行为学评分对立体定向血肿抽吸术的效果进行评估。实验结果1．脑出血抽吸组血肿体积小于脑出血组(P＜0.01)；2．抽吸组和脑出血组的脑组织含水量没有统计学差异(P＞0.05)；3．脑出血抽吸后第3d、7d组的神经功能恢复优于对照组(P＜0.05)。讨论实验性脑出血的动物模型包括4类：自体血注入法、胶原酶诱导法、微球囊充胀法、自发性脑出血。微球囊充胀脑出血模型未涉及到出血和脑实质之间的重要关系；自体血注入脑出血模型血肿形成部位不规则；胶原酶诱导脑出血模型弥补了上述的不足，我们选择了这种模型制作方法简单、快捷且重复性好，血肿形成的部位及体积相对恒定的模型，在血块的溶解剂我们选择了临床上应用广泛、无抗原性、不良反应小且可反复使用的尿激酶。实验证明可以抽吸出暗红色血性液体，量为30～100微升，且脑组织中血肿的体积由41.23 mm~3减少到20.59 mm~3，表明血肿抽吸可以显著减少脑内血肿量，减少血肿压迫及其对正常脑组织化学刺激损伤。而且我们发现在胶原酶注入后3d和7d血肿抽吸组神经功能恢复明显优于脑出血对照组。但是我们没有发现两组之间的脑组织含水量有显著性差异，这可能提示立体定向血肿抽吸术联合内科治疗可能获得更满意的治疗效果。结论在胶原酶诱导的大鼠脑出血模型的基础上经尿激酶溶解血块后实施立体定向血肿抽吸术能较好的清除脑内血肿，促进急性期神经功能恢复。第二部分血肿抽吸术对大鼠脑出血细胞凋亡基因表达的影响目的脑出血是神经系统的常见疾病，是影响人类生存及生活质量的最严重的疾病之一。脑出血后引起机体和脑组织局部一系列病理反应，如脑内血肿，血肿分解产物和脑组织直接损伤释放出的血管活性物质所致的脑水肿，局部脑血流量，凝血纤溶系统的变化等这些变化严重影响脑出血的预后，研究表明，脑出血血肿周边存在一个类似脑缺血的“半暗带(penumbra)”，血肿成分如凝血酶、血红蛋白等均可导致培养细胞发生凋亡，进一步研究脑出血后细胞凋亡的规律和如何早期抑制细胞凋亡以促进神经功能的恢复对指导临床治疗有重要意义。因此，本实验的目的：早期对大鼠脑出血模型应用立体定向血肿抽吸术，通过凋亡细胞及凋亡基因表达产物Bcl-2，Bax，Caspase-3阳性细胞的计数变化，探讨早期立体定向血肿抽吸术对于脑出血后抑制细胞凋亡是否有积极的作用。实验材料和方法1．实验动物和分组：选用健康雄性SD大鼠150只，体重180～220g，鼠龄3～5月，随机大鼠随机分成6组，第1组为正常对照组，第2组为假手术6h、12h、1d、3d、7d、11d组，第3组为脑出血自然恢复6h、12h、1d、3d、7d、11d组，第4组为6h血肿抽吸12h、1d、3d、7d、11d组，第5组为12h血肿抽吸1d、3d、7d、11d组，第6组为1d血肿抽吸3d、7d、11d组。每组每时相点动物6只。2．实验器材和试剂：KOPF型大鼠脑立体定位仪(美国KOPF公司)微量注射器微量分析天平TUNEL试剂盒(Promega公司)免疫组化试剂盒兔抗大鼠Caspase-3(Lab Vision公司提供)兔抗大鼠Bax(天津灏洋公司提供)兔抗大鼠Bcl-2(天津灏洋公司提供)3．实验方法：(1)模型建立后6h、12h、1d、3d、7d、11d处死，应用TUNEL技术以及凋亡相关蛋白Caspase-3，Bax和Bcl-2的免疫组化检测等方法，检测大鼠ICH后不同时相点血肿周边的细胞凋亡情况，并分析ICH后细胞凋亡的变化规律；(2)分别在注入Ⅳ型胶原酶后6h，12h，1d进行血肿抽吸术，于1d，3d，7d检测TUNEL阳性细胞及凋亡相关蛋白Caspase-3，Bax和Bcl-2的表达。4．统计学分析结果以均数±标准差表示，数据间比较采用t检验。P＜0.05，有显著差异。以SPSS10.0进行统计学分析。实验结果1．TUNEL改变TUNEL阳性细胞在6h出现(16.3±2.4)，12hTUNEL阳性细胞开始增多(24.33±2.5)，1d继续增多(60.31±8.96，P＜0.05)，3d达到高峰(104.41±21.45，P＜0.05)，7d至11d阳性细胞在(65.12±18.94和35.17±2.87，P＜0.05)水平。抽吸组TUNEL阳性细胞从注入胶原酶后1d，3d，7d与自然恢复组比较均有明显减少(1d：30.12±18.94，P＜0.05；3d：60.41±21.45，P＜0.05；7d：32.31±8.96，P＜0.05)。2．Caspase-3免疫组织化学染色结果大鼠脑出血后6h基底节区出现Caspase-3蛋白的表达(2.86±2.44，P＜0.05)，12h升高(20.75±5.21，P＜0.05)，1d(60.15±2.15，P＜0.05)达到高峰，在3d(44.21±4.21，P＜0.05)，7d，11d维持在(35.22±1.22，36.22±4.39，P＜0.05)水平。抽吸组Caspase-3阳性细胞从注人胶原酶后1d，3d，7d与自然恢复组比较均有明显减少(1d：37.12±2.14，P＜0.05；3d：27.21±2.14，P＜0.05；7d：17.21±2.33，P＜0.05)。3．Bax免疫组化染色结果大鼠脑出血后6h基底节区出现Bax蛋白的表达(2.55±3.14，P＜0.05)，12h升高(18.22±4.55，P＜0.05)，1d(45.32±5.22，P＜0.05)达到高峰，在3d(40.21±2.12，P＜0.05)，7d，11d维持在(40.01±3.23，38.21±2.33，P＜0.05)水平。抽吸组Bax阳性细胞从注入胶原酶后1d，3d，7d与自然恢复组比较均有明显减少(1d：25.12±2.14，P＜0.05；3d：20.15±4.21，P＜0.05；7d：24.23±5.12，P＜0.05)。4．Bcl-2免疫组化染色结果Bcl-2蛋白在胶原酶注入后6h，Bcl-2的基因表达下降(43.22±2.37，P＜0.05)，12h观察，Bcl-2的基因表达(45.22±2.02，P＜0.05)，1d时Bcl-2的基因表达(42.13±2.11，P＜0.05)，3d时基因表达为(37.13±2.15，P＜0.05)，7d和11d蛋白表达为(45.23±5.11，47.22±8.89，P＜0.05)。抽吸组Bcl-2阳性细胞从注入胶原酶后1d，3d，7d与自然恢复组比较均有明显增强(1d：67.21±9.25，P＜0.05；3d：66.12±20.07，P＜0.05；7d：70.22±4.21，P＜0.05)。讨论近年来流行病学调查发现，脑出血是致人类死亡的第2大病因，病残率极高，相当部分的患者虽早期行血肿清除，但预后仍然不佳，表明脑出血后继发的病理生理改变，对脑细胞造成的损伤是脑出血损伤的重要原因之一。当损伤达到一定程度时引起细胞坏死，而低程度的损伤则导致细胞凋亡。因此，脑出血后继发损伤致神经细胞凋亡成为脑出血治疗中的研究热点。通过对大鼠脑出血模型的研究，证明了神经细胞凋亡参与脑出血后脑损伤病理过程：脑出血后出血灶周围和同侧大脑皮层存在大量TUNEL染色阳性细胞，但是脑出血后启动凋亡级联反应关键因素还没确定。众所周知，脑出血的邻近组织受轻微缺血影响，大量激活血液成分在出血后涌入大脑，其中的细胞因子被活化后引起了细胞的凋亡。近来许多研究发现，在出血脑卒中存在DNA片段化、TUNEL染色阳性和半胱氨酸蛋白酶家族(Caspases)激活等凋亡相关现象，提示了细胞凋亡。本实验TUNEL染色结果显示，脑出血大鼠基底节区中可见大量TUNEL染色阳性神经元，为出血性损害可导致神经元凋亡这一机制提供了依据。除了凋亡的形态学检测，我们对凋亡的基因表达也作了检测。在相邻切片分别进行Caspase-3，Bax，Bcl-2等凋亡相关基因的表达产物的检测。说明脑出血后神经细胞凋亡的发生伴随着Caspase-3，Bax的激活，抑制Bax的Bcl-2蛋白表达呈明显减少趋势。本试验采用了早期立体定向血肿抽吸术干预大鼠脑出血，治疗组在1d，3d，7d三个时间点细胞凋亡数明显低于自然恢复组，差异有显著性(P＜0.05)。凋亡蛋白Caspase-3，Bax蛋白的表达明显低于自然恢复组，Bcl-2表达增加。本实验通对大鼠出血灶周围细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的研究，希望为临床立体定向血肿抽吸术的应用以及神经细胞保护方式的研究提供一定的实验依据。结论1．大鼠脑出血后细胞凋亡与Bcl-2基因、Bax．Caspase-3基因表达相关，证实脑出血后细胞凋亡与线粒体依赖途径有关。2．早期立体定向血肿抽吸术治疗可以减少实验性脑出血细胞凋亡。第三部分血肿抽吸术对大鼠脑出血细胞凋亡信号传导的影响目的脑出血后脑组织细胞的死亡方式既有坏死又有凋亡，其中细胞凋亡作为一种基因调控的细胞死亡方式参与了脑出血后继发性脑损伤的病理过程。进一步研究脑出血后细胞凋亡的规律和如何早期抑制细胞凋亡以促进神经功能的恢复对指导临床治疗有重要意义。本实验旨在通过观察大鼠脑出血大脑出血侧纹状体区细胞凋亡以及凋亡传导信号Cytc、Fas的时程变化，探讨早期微创治疗对脑出血后细胞凋亡信号传导的影响。实验材料和方法1．实验动物：健康雄性SD大鼠78只(体重180-220g，鼠龄3～5月)，随机分为4组：正常组(n=6只)、假手术组(n=6只)、脑出血对照组(n=36只)、血肿抽吸组(n=30只)。2．实验器材和试剂：kopf型大鼠脑立体定位仪(美国kopf公司)微量注射器TUNEL试剂盒(Promega公司)免疫组化试剂盒兔抗大鼠Caspase-3(Lab Vision公司提供)鼠抗大鼠Cytc(Santa cruz公司提供)羊抗大鼠Fas(TD公司提供)3．实验方法：(1)模型建立后6h、12h、1d、3d、7d、11d处死，应用TUNEL技术以及凋亡传导信号相关蛋白Cytc、Fas的免疫组化检测等方法，检测大鼠ICH后不同时相点血肿周边的细胞凋亡情况，并分析ICH后细胞凋亡的变化规律；(2)在注入Ⅳ型胶原酶后6h进行血肿抽吸术，于6h，12h，1d，3d，7d，11d，检测TUNEL阳性细胞及凋亡传导信号相关蛋白Cytc、Fas的表达。4．统计学分析：结果以均数±标准差表示，数据间比较采用进行方差分析和相关分析，P＜0.05表示差异有显著性。实验结果1．脑出血组各时间点细胞凋亡数均明显高于对照组和假手术组，差异有显著性P＜0.05，1d～11d的细胞凋亡数明显高于血肿抽吸组，差异有显著性P＜0.05。2．自然恢复组出血侧大脑纹状体区Cytc、Fas表达高峰在3～7d出现；血肿抽吸组在时间点12h～7d Cytc的表达及3d Fas的表达明显低于自然恢复组，差异有显著性P＜0.05。讨论在细胞凋亡的发生发展过程中，主要信号转导通路有两条：一为死亡受体信号转导通路：Fas—FasL系统介导细胞凋亡的信号传导，Fas—FasL系统的发现为PCD机制增加了新的认识，使以往对PCD胞浆及核内事件的认识与膜信号传导机制联系起来。已有研究表明，某些细胞在其发生发展过程中Fas的表达不断增加，而凋亡抑制基因Bcl-2的表达逐渐减少，最终导致细胞凋亡的发生，完成细胞代谢过程，达到细胞增殖与死亡的平衡。可见细胞凋亡不仅受细胞本身的ced-3、Bcl-2等的控制，还受Fas—FasL系统的调控。细胞膜表面表达有可能的Fas蛋白，并且其表达量达到一定程度是通过Fas—FasL途径诱导凋亡作用的首要条件；二为线粒体信号转导通路：Cytc在dATP存在的情况下，与Apaf-1结合，使Apaf-1暴露其上的CARD(caspase activation and recruitment domain)基序，并与procaspase-9的CARD结合形成凋亡复合体(apoptosome)，导致procaspase-9激活，后者进一步激活Caspase-3，6等，从而诱导细胞凋亡。我们在相邻切片分别进行Cytc、Fas和TUNEL染色，其阳性范围及时间变化基本相同，说明脑出血后神经细胞凋亡的发生伴随着Cytc或Fas的激活。早期立体定向血肿抽吸术组1d，3d，7d，11d各时间点细胞凋亡数明显低于自然恢复组，差异有显著性P＜0.05。结论立体定向血肿抽吸术可以显著减少大鼠脑出血细胞凋亡，其机制可能是干扰线粒体信号的传导途径。