单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）是一种重要的食源性人兽共患病原菌,能引起人和动物以脑膜炎、败血症、流产等为主要特征的李斯特菌病。近年来,由该菌引起的人和动物李斯特菌病频发,不仅给畜牧业造成了经济损失,还严重威胁了公众健康。因此,建立灵敏特异、快速简便的李斯特菌病诊断方法,将有助于该病的预防和控制。Lm为革兰氏阳性兼性胞内寄生菌,其致病性依赖于细菌毒力因子的产生。其中细菌表面蛋白ActA蛋白是其主要毒力因子,作为肌动蛋白聚集因子,对该菌的胞间扩散与传播中发挥重要作用。本研究以ActA抗原为靶标抗原、应用酶标ActA单克隆抗体建立竞争ELISA方法,并研制ActA单抗竞争ELISA试剂盒,该试剂盒能够高效特异地检测Lm的感染,为李斯特菌病的快速诊断提供技术支撑。1.ActA蛋白的表达及免疫原性分析靶标抗原良好的免疫原性是建立血清学诊断方法的基础。为了评价ActA蛋白抗原性,以重组菌株BL21（DE3）（pET-30a-actA）为实验材料,诱导表达了 97 KDa的rHis-ActA重组蛋白,并进行了 Western blot鉴定。在此基础上,采用间接ELISA方法,对Lm菌株感染小鼠后诱导的ActA血清抗体水平进行了动态测定。结果表明,在感染小鼠后的第6天,产生了针对ActA的特异性抗体,第10天的抗体水平最高,滴度为1:6400,抗ActA的抗体一直持续至22天,表明该蛋白具有良好的抗原性。此外,制备了 ActA单抗杂交瘤细胞3G11株的腹水单抗并进行了纯化标记,进一步测定了该单抗3个轻链可变区互补决定区和3个重链可变区互补决定区的氨基酸序列。上述研究表明,ActA蛋白是建立李斯特菌血清学检测方法的良好候选抗原。2.ActA单克隆抗体竞争ELISA方法的建立为了建立竞争ELISA检测方法,首先对ActA蛋白的包被浓度及HRP标记的ActA单抗的工作浓度进行了摸索,通过ELISA棋盘法确定rHis-ActA的最佳包被浓度为2.0μg/mL,HRP-3G11酶标抗体的工作浓度为1:32000（36.2 ng/mL）。在此基础上,逐一对竞争ELISA各试验条件进行优化,最终确定检测条件及步骤如下:以CBS缓冲液将抗原稀释至工作浓度,4℃包被16 h;加入封闭液（2%脱脂奶-PBS）于37℃封闭3 h;加入1:10稀释的血清和1:32000稀释的酶标抗体各50μL,37℃孵育1 h;37℃显色3 min。通过ROC曲线确定检测阈值,确定该竞争ELISA方法的阈值为27.5%。同时对ActA单抗竞争ELISA方法的敏感性、特异性和稳定性进行测定,结果表明该方法的敏感性和特异性分别达到100%和93.3%,与其他常见病原菌的阳性血清无交叉反应,且试验结果具有良好的重复稳定性。综上所述,该方法稳定性良好,特异性和敏感性较强,为李斯特菌病的血清学诊断奠定了基础。3.ActA单克隆抗体竞争ELISA试剂盒的研制与初步应用在建立的竞争ELISA方法基础上,进一步研制ActA单克隆抗体竞争ELISA试剂盒,并对其保存期、与商品化试剂盒的符合率、质量检验等方面进行测定,并进行了初步的应用。结果显示,对试剂盒进行批内、批间和不同操作者重复稳定性检测时,变异系数均在15%以内,表明该试剂盒性能稳定、重复性较好。通过使用酶标抗体保护剂,有效提高了 ELISA试剂盒的保质期,使其在4℃保存条件下,有效期大于10个月,并保持良好的检测效果和质量检验结果。比较分析表明,该试剂盒与Diatheva公司的试剂盒对47份临床羊血清样品进行检测,符合率达95.7%。最后应用该试剂盒分别检测了来自国内不同养殖场的928份羊血清样品和510份牛血清样品,发现羊血清和牛血清样品平均阳性率分别为23.0%和14.1%。总之,ActA单抗竞争ELISA方法的建立及研制的试剂盒,可以有效检测李斯特菌病。综上所述,本研究基于具有良好抗原性的ActA蛋白,建立了灵敏、特异的竞争ELISA方法,在此基础上,研制了 ActA单抗竞争ELISA检测试剂盒,该试剂盒具有良好的重复性和稳定性,可以有效、快速的检测Lm的感染,为李斯特菌病的精准防控奠定了基础。