【摘 要】
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研究目的:BST-2（bone marrow stromal antigen-2）是限制HIV-1释放的宿主限制因子,HIV-1编码的辅助蛋白Vpu介导BST-2经泛素化修饰而被降解,从而抵消BST-2的限制作用。泛素化修饰是可逆的过程,是否存在去泛素化酶（DUB）逆转BST-2的泛素化修饰目前还不清楚。本研究通过对人类基因组编码的98个DUB的筛选来鉴定参与逆转BST-2泛素化修饰的DUB。研究
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研究目的:BST-2（bone marrow stromal antigen-2）是限制HIV-1释放的宿主限制因子,HIV-1编码的辅助蛋白Vpu介导BST-2经泛素化修饰而被降解,从而抵消BST-2的限制作用。泛素化修饰是可逆的过程,是否存在去泛素化酶（DUB）逆转BST-2的泛素化修饰目前还不清楚。本研究通过对人类基因组编码的98个DUB的筛选来鉴定参与逆转BST-2泛素化修饰的DUB。研究方法:首先使用蛋白酶体抑制剂MG132和广谱的去泛素化酶抑制剂PR-619证明Vpu介导BST-2的降解经蛋白酶体途径,且有DUB参与逆转该过程。接着,通过对人类基因组编码的98个DUB基因小干扰RNA（siRNA）文库的筛选,确定在Vpu介导BST-2降解过程中具有显著功能的潜在研究对象。HeLa细胞内源组成性表达BST-2,因此采用稳定表达Vpu的HeLa细胞（HeLa-Vpu）作为筛选系统。在该系统中,通过流式细胞术检测对照组和DUB敲低表达组中内源性BST-2的平均荧光强度（MFI）。初步筛选出候选DUB后,再通过流式细胞术检测对照组和DUB过表达组中内源性BST-2的MFI。在293T细胞中采用同样的方法,过表达或敲低候选DUB的表达,通过流式细胞术检测外源性BST-2的MFI,由此确定在BST-2降解过程中具有显著功能的DUB。为了探究候选DUB对HIV-1释放的影响,在293T细胞中分别共转染BST-2、stHIV感染性克隆和DUB表达质粒或DUB-siRNA,采用酶联免疫法（ELISA）分别检测上清和细胞中的p24浓度,计算HIV-1的释放率。最后,采用免疫荧光染色的方法在共聚焦显微镜下观察OTUD1与BST-2在细胞中的定位情况。研究结果:通过检测不同工作浓度的MG132和PR-619处理对Vpu介导BST-2降解的影响,发现MG132处理后BST-2的表达水平显著上调,PR-619处理后BST-2的表达水平显著下调,说明Vpu介导BST-2的降解经蛋白酶体途径,且有DUB参与逆转Vpu介导BST-2的降解。在HeLa-Vpu细胞中对98个人源DUB基因siRNA文库的多轮筛选,发现敲低BAP1、USP26、USP44、USP45和OTUD1的表达,内源性BST-2的表达水平明显下调。相反,过表达5个候选DUB时,内源性BST-2的表达水平均被上调。接着,在293T细胞中验证5个候选DUB对外源性BST-2表达的影响,结果与内源性一致,其中OTUD1的作用最显著。ELISA检测5个候选DUB对HIV-1释放的影响,发现敲低5个DUB后,均明显促进了 HIV-1的释放;过表达5个DUB,只有OTUD1抑制了 HIV-1的释放。激光共聚焦显微镜观察到OTUD1与BST-2在细胞中存在共定位,提示OTUD1可能与BST-2之间存在相互作用。研究结论:通过对98个人源DUB基因的siRNA文库的全面筛选,发现BAP1、USP26、USP44、USP45和OTUD1这5个DUB参与调节BST-2降解的过程。其中OTUD1的敲低明显促进了 HIV-1的释放,过表达OTUD1则抑制了 HIV-1的释放。且OTUD1与BST-2在细胞中存在共定位。总之,本研究发现在众多DUB中OTUD1具有调节BST-2稳定性的功能,提示其可能是逆转BST-2泛素化修饰进而恢复BST-2限制病毒释放能力的DUB。
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