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猪圆环病毒病（PCVD）是由猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）引起的猪免疫抑制性疾病,其临床表现主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）和猪皮炎肾病综合征（PDNS）、新生仔猪先天性震颤（CT）、母猪繁殖障碍、肠炎、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）等。PCVD自二十世纪末爆发以来,在全球广泛发生与流行,给养猪业.造成了巨大的经济损失。依据遗传距离P值≧0.035的基因型分类原则,PCV2可以分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e五种基因型,其中PCV2a、PCV2b和PCV2d呈全球分布;2002年以前主要为PCV2a,2003年之后PCV2b逐渐转变为主要流行基因型,PCV2d是2009年才出现的一种新的基因型,并已成为中国和美国等国猪群中的主要流行基因型。大量数据表明,基于基因型PCV2a或PCV2b的商用疫苗在许多方面是有效的,包括降低PMWS的发病率、混合感染的数量、淋巴组织病变的严重程度、PCV2病毒血症水平、显微病变的严重程度以及提高平均日增重和饲料转化率等。但是,现行疫苗免疫不能阻止病毒的感染,也无法清除体内的病毒,而且,同源疫苗比异源疫苗能更好地降低同一基因型的病毒血症。在美国,免疫了基于PCV2a的商品化疫苗的猪群,仍有PMWS发生,猪体内能检出高载量的PCV2,表明有必要加快研制基于PCV2d的新型疫苗。另外,我国目前广泛使用的是PCV2全病毒灭活疫苗,但PCV2在细胞上的增殖滴度低,疫苗制造成本高,而且由于PCV2灭活较为困难,灭活疫苗存在潜在的生物安全风险。而亚单位疫苗安全性高、免疫应激小、产生抗体更早、保护力强,临床应用效果优于全病毒灭活疫苗。本研究对近4年收集的江苏省及其周边地区发病猪的病料进行PCV2的PCR检测和序列测定,基于大数据分析PCV2毒株的基因型和遗传多样性,掌握PCV2流行的基因型和遗传变化规律,并研制出基于PCV2d流行毒株的猪圆环病毒重组杆状病毒载体灭活疫苗,为更为有效地防控PCVD提供支撑。1.2014-2017年江苏省猪圆环病毒2型遗传变异分析利用PCR对江苏省及其周边地区2014-2017年发病猪的样品进行PCV2检测,并进行全长序列测定及分析。从1806份临床样品中检测出PCV2阳性样品748份,阳性率为41.42%。从中共获得了 268株PCV2全长序列,序列比对结果表明:有16株序列全长为1768nt,分类为PCV2a;245株序列全长为1767nt,其中84株为PCV2b、161株为PCV2d;另有7株由于其1039位缺少一个G,所以序列全长为1766nt,但亦属于PCV2d;PCV2a、PCV2b和PCV2d三个基因型所占比例分别为6%、31.3%和62.7%,没有检测到PCV2c和 PCV2e。同源性分析结果显示:各毒株全长序列之间的同源性为94.5-100%;各基因型内的同源性为96.9-100%,PCV2b毒株之间的同源性最高,PCV2a毒株之间的离散度相对较大,PCV2d明显分成两个亚群,各亚群内的同源性达到99.5-100%,而各亚群之间的同源性为98.1-98.5%。各基因型之间,PCV2a与PCV2b、PCV2d的同源性分别为 95.1-96.0%和 94.4-95.0%;PCV2b 与 PCV2d 的同源性为 96.1-97.6%,明显高于与PCV2a之间的同源性。各毒株ORF1核苷酸及其编码蛋白的氨基酸序列同源性都比较高。核苷酸序列同源性为97.1-100%;各基因型内,差异比较明显的仍然是PCV2d,同全长序列一样,可以分成两个亚群,同亚群之间的同源性为99.1-100%,不同亚群之间的同源性为97.2-98.0%;PCV2b毒株之间的同源性最高,达到99.5-100%;PCV2a毒株之间同源性为98.7-100%;各基因型之间,同源性为97.1-100%。表明PCV2 ORF1较为稳定,变异相对较小,而且各个基因型之间的差异也不明显,尤其是PCV2d的两个亚群之间的差异比其中一个亚群与PCV2b之间的差异还要大。氨基酸序列较其核苷酸序列,同源性更高,各基因型内氨基酸序列的同源性都达到99.0-100%,变异相对较小,而且各个基因型之间的差异也不明显,同型及异型之间不少毒株的同源性都达到100%,且绝大多数都只有1-2个氨基酸的差异。有意思的是,PCV2d ORF1的核苷酸序列明显分成两个亚群,两个亚群之间的氨基酸序列差异变的非常小,仅有1个氨基酸不同。表明PCV2d ORF1的核苷酸序列存在较多的无意义突变。相比ORF1的相对稳定,ORF2的变异十分显著,所有毒株的OFR2核苷酸序列的同源性为88.3-100%;各基因型内,PCV2b毒株之间的同源性最高,达到98.9-100%,PCV2d之间的同源性也比较高,为98.3-100%,差异最大的是PCV2a,同源性为93.1-100%。但各基因型之间,核苷酸序列的同源性明显降低,PCV2a与PCV2b之间的同源性只有90.9-92.5%,与PCV2d之间更降至88.3-90%;PCV2b与PCV2d之间的同源性稍大一些,为93.9-95.6%。氨基酸同源性的差异与核苷酸基本一致。本试验结果提示:江苏及其周边地区猪群中同时存在PCV2a、PCV2b和PCV2d感染,PCV2d为主要流行基因型,应进一步加强对PCV2d的免疫与防控技术研究。2.PCV2 ORF2基因重组杆状病毒表达载体的构建与免疫特性研究将猪圆环病毒2型（PCV2d）ORF2作为免疫原基因分别克隆到载体pFastBacTMDual的PH和p10两个克隆位点,构建双拷贝重组质粒pF-ORF2,通过筛选获得阳性克隆并测序;将序列验证正确的重组质粒转染Sf9细胞,获得猪圆环病毒（PCV2）ORF2基因重组杆状病毒rB-cap,经IFA、SDS-PAGE、Western blotting检测,重组Cap蛋白在Sf9细胞中得到表达,分子量约28kD,双拷贝重组病毒的表达量明显高于单拷贝重组病毒;双拷贝重组杆状病毒rB-cap在Sf9细胞上的病毒含量为107.5TCID50/mL;用重组Cap蛋白制成灭活疫苗（含重组Cap蛋白10μg/mL）1mL免疫19-21日龄健康仔猪,21天后用PCV2d强毒进行攻毒,结果不免疫攻毒组猪5/5发病,免疫组猪5/5获得保护,表明构建的猪圆环病毒（PCV2）ORF2基因重组杆状病毒rB-cap能高效表达Cap蛋白,免疫原性优良,是一个理想的疫苗候选毒株。3.猪圆环病毒杆状病毒载体灭活疫苗（rB-cap株）研制构建的猪圆环病毒（PCV2）ORF2基因重组杆状病毒rB-cap株能稳定继代20代以上,以rB-cap为制苗毒株,建立了种毒批,制备了 3批次猪圆环病毒杆状病毒载体灭活疫苗实验室产品,经检验合格后,按规程要求开展了一系列实验室试验。结果表明,3批次疫苗单剂量/大剂量一次接种、重复接种仔猪均不引起任何不良反应;17-21日龄健康仔猪一次肌肉注射1mL,21天后攻毒,能获得4/5以上的保护;疫苗免疫持续期可达4个月以上;疫苗在4℃可保存一年以上。与同类制品比较试验结果显示,该疫苗达到国外亚单位疫苗水平,优于国内全病毒灭活疫苗。表明已成功研制出安全高效的猪圆环病毒杆状病毒载体灭活疫苗（rB-cap株）。