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鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,简称MG)是鸡慢性呼吸道疾病的病原体,主要通过定殖于宿主呼吸道建立慢性感染,引起呼吸道组织的损伤和一系列病理变化。该病广泛分布于世界各地,给家禽养殖业造成了巨大的经济损失,迄今仍未找到有效的防控措施。深入研究MG的致病机制,有助于该病的预防及治疗方法的寻找。大量研究表明,mi RNA在病原致病中发挥着重要的作用,本研究旨在探讨高通量测序筛选出的gga-mi R-101-3p在MG感染中的作用,为阐明MG的致病机理提供科学依据。实验以鸡毒支原体HS株(MG-HS)感染鸡胚及DF-1细胞为对象,运用Real-time Quantitative PCR(q PCR)方法检测感染与非感染组织、细胞中gga-mi R-101-3p及其靶基因的表达量;应用双荧光素酶报告基因系统对gga-mi R-101-3p的靶基因进行验证;进一步通过gga-mi R-101-3p的超表达和抑制实验来确证gga-mi R-101-3p与靶基因的调控关系。利用MTT法检测DF-1细胞的增殖及流式细胞仪检测细胞周期的变化,了解gga-mi R-101-3p对DF-1细胞生物学的影响。主要成果如下:1.检测了gga-mi R-101-3p在MG-HS感染与非感染鸡胚(12-20日龄)肺组织及DF-1细胞中的表达量。gga-mi R-101-3p在17 d、18 d、19 d MG-HS感染鸡胚的肺组织中的表达量极显著高于正常对照组(p<0.01),而13 d、14 d时极显著低于正常对照组(p<0.01),20 d时显著低于正常对照组(p<0.05)。MG-HS感染DF-1细胞中gga-mi R-101-3p在的表达量极显著高于正常对照组(p<0.01)。2.利用在线软件mi RDB、Mir Target2和Target Scan等预测了gga-mi R-101-3p的靶基因,通过RNAhybrid等软件对gga-mi R-101-3p与EZH2 3’UTR靶序列的碱基配对情况、二者结合形成RNA双链的二级结构和自由能,以及靶序列在不同物种间保守性等主要生物信息学指标进行了归纳分析,并结合功能分析初步确定EZH2为gga-mi R-101-3p的靶基因。3.通过双荧光素酶报告系统分析,gga-mi R-101-3p能显著抑制EZH2 3’UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性,揭示了gga-mi R-101-3p是通过与EZH2 3’UTR结合而发挥作用,初步确定EZH2可能是gga-mi R-101-3p的靶基因。4.gga-mi R-101-3p超表达和抑制实验表明,在DF-1细胞中转染gga-mi R-101-3p mimics能显著抑制EZH2基因m RNA和蛋白的表达;而转染gga-mi R-101-3p inhibitor后,EZH2基因m RNA和蛋白的表达则显著上调。进一步证实了EZH2是gga-mi R-101-3p的靶基因,且gga-mi R-101-3p负向调控EZH2的表达。5.q PCR分析了EZH2在MG-HS感染与非感染鸡胚(12-20日龄)肺组织、DF-1细胞中的表达量。结果显示,18 d、19 d MG-HS感染鸡胚的肺组织中EZH2的相对表达量极显著低于与正常对照组(p<0.01),20 d时极显著高于正常对照组(p<0.01);且在MG-HS感染DF-1细胞中,EZH2的表达量极显著低于正常对照组(p<0.01),说明EZH2与gga-mi R-101-3p的表达量呈明显负相关。6.超表达gga-mi R-101-3p能显著抑制DF-1细胞的增殖,且使细胞周期停滞在G1期,不能进入S期进行DNA的合成与复制。