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薄皮甜瓜(Cucumis melo var. makuwa Makino)口感优良、香气独特,是中国重要的甜瓜品种资源。植物脂氧合酶(lipoxygenase, LOXs)是以多基因家族形式存在,不同基因家族成员在植物生长发育、成熟衰老、逆境调控以及香气物质合成中发挥重要的作用。香气物质是衡量薄皮甜瓜果实品质的重要指标之一,脂氧合酶可能在薄皮甜瓜果实挥发性物质合成中发挥重要作用。本试验以薄皮甜瓜“玉美人”(Cucumis melo var. makuwa Makino)为研究对象,鉴定了甜瓜LOX基因家族成员,并进行生物信息学分析；研究了LOX基因家族成员的时空表达特性；对不同类型的LOX基因家族成员进行克隆,并且研究了不同采后处理(乙烯、1-MCP、乙醇及低温)对LOX基因家族成员的表达调控；通过酵母真核表达系统对CmLOX18蛋白的生化特性进行研究；利用转基因技术将CmLOX18导入番茄(Solanum lycopersicum)植株中,探究了其在果实C6香气物质合成中的作用。主要研究结果如下：1.利用甜瓜基因组数据库,鉴定了18个LOXs基因家族成员,分别命名为CmLOX01-CmLOX18,其中有11个成员(CmLOX03-10, CmLOX12-13和CmLOX18)具有完整的或者接近完整的核苷酸编码区(ORF),其余7个成员(CmLOX01-02, CmLOX11和CmLOX14-17)不具有完整的编码区,但均具备典型LOX保守的38个氨基酸结构域(His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His);甜瓜LOX基因家族成员的序列同源性存在差异,CmLOX12和CmLOX13的氨基酸序列同源性最高约为80%,而CmLOX01与CmLOX16之间的同源性仅为14%；系统发育树分析表明,甜瓜LOXs基因家族成员分别隶属于不同的类群,其中Ⅰ类LOX包含CmLOX01-07和CmLOX09,Ⅱ类LOX包含CmLOX08、CmLOX10-16和CmLOX18;根据特异性氧结合位点,发现仅有CmLOX07和CmLOX09具备9-LOX催化活性,而其余的除CmLOX17外均具备13-LOX催化活性。2.本试验通过半定量PCR技术(SqPCR)和实时荧光定量PCR技术(Qpcr),以薄皮甜瓜根、茎、幼叶、花、生长发育各个阶段的果实(花后5d至花后40d,每间隔5d,取一次样)、种子为试验材料,对甜瓜CmLOXs成员在长发育过程中的基因表达时空差异性进行了研究。甜瓜18个LOX基因家族成员中,其中17个家族成员广泛分布于不同的组织器官中,而CmLOX07在任何一个组织器官中均检测不到转录信号；CmLOX03、 CmLOX05和CmLOX06具有相同的组织表达模式,这3个基因家族成员在除幼叶外的器官中均存在；CmLOX09和CmLOX18在除雌花外的所有组织器官中均可以检测到转录信号；CmLOX15在营养器官中不表达,仅在生殖器官中表达；CmLOX11、 CmLOX12、CmLOX14、CmLOX16和CmLOX17在茎中均检测到转录信号,CmLOX12在雌花和雄花中均不表达,而CmLOX14和CmLOX17在幼叶中均不表达；CmLOX01、 CmLOX03和CmLOX18在果实生长发育各个时期表达水平相对稳定,在果实逐渐成熟过程中,基因表达水平逐渐增加；CmLOX06在花后5d到10d果实生长发育前期增加的水平相对缓慢;然而,《CmLOX02、CmLOX04、CmLOX08、CmLOX09、CmLOX10、 CmLOX11、CmLOX13、CmLOX14、CmLOX15和CmLOX16均在花后5d达到一个相对较高的水平,而随后下降。这些结果暗示了LOX基因家族在甜瓜不同器官及果实生长发育过程中起着关键作用,且存在成员之间的功能差异。3.为了研究不同采后处理对甜瓜脂氧合酶基因家族成员的影响,甜瓜中三种类型的LOXs基因家族成员(类型1 13-LOXs,类型1 9-LOXs和类型2 13-LOXs)CmLOX03、 CmLXO09和CmLOX18被选为候选基因并进行了克隆。在薄皮甜瓜花后28d采收果实,分别进行外源乙烯、(1-methylcyclopropene) 1-MCP、乙醇和低温处理,研究了采后处理对这三种不同类型的LOXs基因家族成员的表达调控。结果表明3个基因在甜瓜采后成熟衰老期间具有表达差异：CmLOX03和CmLOX18明显受乙烯的诱导,受1-MCP抑制；乙烯处理并没有影响CmLOX9在贮藏期间的转录水平,CmLOX9不受乙烯和1-MCP调控；乙醇和低温处理同样抑制了对乙烯敏感型LOX基因CmLOX03和CmLOX18成员的表达水平,但是对非乙烯敏感的CmLOX9并没有影响。这些结果表明CmLOX03和CmLOX18可能参与了果实的采后成熟衰老,且存在成员功能差异性,但是关于LOX与乙烯之间的相互调控机制还需进一步研究。4.通过酿酒酵母真核表达系对CmLOX18重组蛋白进行异源表达,并将重组体蛋白进行纯化,测定纯化蛋白的酶学特性；通过高效液相色谱法(HPLC)对CmLOX18重组体蛋白的催化生成产物进行研究,确定CmLOX18蛋白的催化特性；通过聚乙二醇(PEG)介导法,CmLOX18转入拟南芥原生质体中,对CmLOX18进行亚细胞定位。研究表明：在pH 3.0-pH 9.0的缓冲液中,CmLOX18酶最高活性出现在pH 4.5；在20℃-45℃温度范围内检测该酶活性的变化,表明在30℃条件下,CmLOX18催化活性最高；重组蛋白CmLOX18的酶动力学参数,检测发现米氏常数Km值在以亚油酸(linoleic acid, LA)为底物时,显著高于亚麻酸(linolenic acid, LeA);两种底物比较,酶促反应最大速度Vmax值,亚油酸约是亚麻酸的4倍,因此,亚油酸是重组蛋白CmLOX18的最适底物；HPLC分析表明,CmLOX18酶促反应产物13S-HPOD,因此确定CmLOX18为13S-LOX类型；亚细胞定位结果表明,CmLOX18定位于植物的非叶绿体细胞器中。5.通过Gateway技术将CmLOX18转入植物超表达载体中,利用农杆菌介导法,将甜瓜CmLOX18转入“中蔬6号”番茄中；利用PCR、Southern blot、western blot以及活体荧光成像仪鉴定T0代转基因植株；通过实时荧光定量技术检测T1代转基因果实中CmLOX18、LeHPL和番茄LOXs基因家族成员的表达水平；利用气质联用仪(GC-MS)对T1代转基因果实挥发性物质含量进行检测。结果表明：T1代转基因果实中,甜瓜CmLOX18转入引起了番茄LeHPL基因表达水平显著高于“中蔬6号”番茄,但是并未引起番茄内源LOX基因家族成员TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD、TomloxE和TomloxF基因表达水平的显著改变；转基因植株果实正己醛、反-3-己烯醛和反-3-己烯-1-醇等C6香气物质含量显著高于“中蔬6号”；C5化合物(1-戊醇和1-戊烯-3-酮)在“中蔬6号”和转基因果实中并没有显著差异。这些结果表明,转基因果实中C6挥发性物质的升高,是由于甜瓜CmLOX18导入和LeHPL基因表达水平升高引起的,CmLOX18可能通过hydroperoxide lyase (HPL)分支途径参与C6香气物质的合成。