【摘 要】
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目的：为研究小鼠Noggin基因的功能和作用,我们拟克隆小鼠Noggin基因,构建了定点整合型毛囊特异性表达载体pDs-MSKTLNE,进而对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和小鼠成肌细胞(C2C12)进
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目的：为研究小鼠Noggin基因的功能和作用,我们拟克隆小鼠Noggin基因,构建了定点整合型毛囊特异性表达载体pDs-MSKTLNE,进而对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和小鼠成肌细胞(C2C12)进行转染,之后通过G418和GANC共同筛选以获得稳定表达Noggin基因定点整合的转基因细胞克隆,验证pDs-MSKTLNE构建的合理性。本研究结果为Noggin基因的功能研究提供了前期基础数据。本实验的另一个目的在于探讨小鼠11号染色体的角蛋白16与角蛋白14之间的这段区间是否可以作为高等生物的另一个打靶位点。1.小鼠Noggin基因定点整合型载体的构建构建一套用于小鼠Noggin基因定点整合的置换型打靶载体pDs-MSKTLNE,为定点整合的同源重组打靶载体,载体部分包含5.0kb左右的同源长臂和4.0kb左右的同源短臂,人源性K14启动子,由它启动的目的基因Noggin,以及作为正筛选标记的Neor基因,和负筛选标记HSV-TK基因。首先克隆获得这些片段,然后依次将这些片段按同源短臂,HSV-TK,同源长臂,人源性K14启动子,以及目的基因Noggin的顺序连接至载体骨架上2.Noggin基因定点整合小鼠成纤维细胞和成肌细胞的制备利用AgeI线性化打靶载体pDs-MSKTLNE,按照脂质体试剂盒操作说明,700ug的线性化质粒+2ul脂质体,共同孵育30分钟,转染事先饥饿处理的胎儿成纤维细胞(MEF),经G418和GANC筛选15天,一共得到了103个抗性克隆,通过PCR鉴定,没有得到发生同源重组的阳性克隆。其中,成纤维细胞随机整合效率为23.3%(24/103)。利用线性化打靶载体pDs-MSKTLNE利用AgeI线性化打靶载体pDs-MSKTLNE,用脂质体试剂盒操作说明,1000ug的线性化质粒+2ul脂质体,共同孵育30分钟,转染事前饥饿处理的转染小鼠成肌细胞(C2C12),经G418和GANC筛选,一共得到了124个G418抗性克隆,经PCR鉴定,通过PCR鉴定,没有得到发生同源重组的阳性克隆。其中成肌细胞随机整合效率为34.6%(43/124)。
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