研究背景:肝癌是严重的人类恶性疾病之一,被列为第二大最常见的与肿瘤相关的死亡原因,近年来肝癌的发病率和死亡率一直在增加。肝癌生物学的进展表明,参与肝癌发展的各种体细胞遗传改变、肝癌亚型、诊断、抗药性和复发的分子机制非常复杂,仍然是我们面对的重大医学难题,亟待进一步研究,并且目前缺乏有效的抗肝癌药物。二甲双胍(N,N-二甲基双胍)是用于治疗II型糖尿病的最广泛使用的药物之一,主要通过减少肝糖异生和增加骨骼肌中的葡萄糖储存来降低血糖水平。流行病学研究发现,与未经二甲双胍治疗组相比,二甲双胍在治疗的II型糖尿病的同时可以降低各种癌症(包括肝癌)的发生率。近些年来,随着对二甲双胍研究的深入,发现其在抑制肿瘤生长方面也具有十分显著的效应,同时还发现长期使用二甲双胍能降低多种肿瘤发生的风险。其中二甲双胍对肝癌的作用现已基本明确,有研究显示,二甲双胍能够降低原发性肝癌的发病率。体外细胞研究显示,二甲双胍能抑制Bcl-2基因表达抑制Hep G2细胞株的增殖,发挥抗肿瘤效应;但是目前关于二甲双胍抗肿瘤的机制仍知之甚少尚存在争议。近年来有研究表明,在肝癌细胞中也存在一定程度的自噬,当自噬程度增加时可以诱导肝癌细胞的凋亡,抑制肝癌细胞的增殖。众所周知,二甲双胍的降糖作用是启动AMPK信号转导通路产生的。AMPK的启动可以磷酸化下游的TSC2蛋白,产生具有GTP酶启动蛋白活性的TSC1/TSC2异二聚体复合物,促使Rheb失活,从而抑制mTOR复合物1。并且二甲双胍对mTOR的抑制还可不依赖与AMPK的启动,通过调节胰岛素受体或胰岛素样生长因子而实现,即二甲双胍可以通过各种通道导致mTOR信号通路的抑制,提示二甲双胍很可能对于自噬具有十分重要的调节作用。因此我们提出科学假设:二甲双胍是通过增强肝癌细胞自噬从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移。为证实这一科学假设,我们进行了如下实验:(1)明确二甲双胍对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用;(2)明确二甲双胍对肝癌细胞凋亡的作用;(3)明确二甲双胍是否通过促进自噬产生抗肿瘤的作用。目的:1.探究二甲双胍对肝癌Hep G2细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的作用。2.探明二甲双胍对肝癌细胞凋亡的作用;3.探究二甲双胍对Hep G2细胞PAMPK、Atg14及LC3-Ⅱ等自噬相关蛋白的影响。4.分析二甲双胍抑制肝癌的潜在作用机制。方法:选用Hep G2细胞作为研究对象,将细胞随机分成四组:生理盐水组、二甲双胍1 m M组、二甲双胍5 m M组、二甲双胍10 m M组。常规培养Hep G2细胞。生理盐水组、二甲双胍1 m M组、二甲双胍5 m M组、二甲双胍10 m M组细胞分别给与生理盐水、1 m M二甲双胍、5m M二甲双胍、10m M二甲双胍处理。采用MTT检测各组细胞的细胞活力并计算增殖抑制情况,并选取效果最好的剂量;采用划痕实验及Transwell实验检测二甲双胍对Hep G2细胞侵袭能力的影响;采用Annexin V-FITC方法及流式细胞仪检测二甲双胍对Hep G2细胞凋亡的影响;采用蛋白印迹杂交检测二甲双胍对Hep G2细胞P-AMPK、Atg14及LC3-Ⅱ等自噬相关蛋白的影响。结果:1.MTT结果显示,生理盐水组、二甲双胍1 m M组、二甲双胍5 m M组、二甲双胍10 m M组在处理24h、48h、72h、96h细胞活力比较差异具统计学意义(P<0.05),其中生理盐水处理的Hep G2细胞活力高,增殖速度快,而给予二甲双胍后,Hep G2细胞活力下降,增殖速度降低,且随着二甲双胍浓度的增加,Hep G2细胞活力随之降低(P<0.05)。平板克隆实验显示,生理盐水组、二甲双胍10 m M组Hep G2细胞增殖率比较差异具统计学意义(P<0.05),二甲双胍10 m M组Hep G2细胞增殖率显著低于生理盐水组,差异具统计学意义(P<0.05)。2.划痕实验显示,生理盐水组、二甲双胍10 m M组细胞处理24h时细胞迁移距离比较差异具统计学意义;当给予Hep G2生理盐水时,细胞有着较强的迁移能力,当给予Hep G2细胞二甲双胍时则能显著抑制其迁移距离显著低于生理盐水组,差异具统计学意义(P<0.05)。3.transwell实验显示,生理盐水组、二甲双胍10 m M组细胞处理24h时细胞侵袭率比较差异具统计学意义,二甲双胍10 m M组细胞侵袭能力显著低于生理盐水组(P<0.05)。4.流式结果显示,生理盐水组细胞凋亡较少,当给予细胞二甲双胍后,Hep G2细胞凋亡显著增加,且有显著的统计学差异(P<0.05);western blot方法显示Hep G2细胞二甲双胍后cleaved caspase-3表达明显增加(P<0.05)。5.western blot检测自噬相关蛋白显示,与生理盐水组比较,二甲双胍10 m M组P-AMPK、Atg14及LC3-Ⅱ表达明显升高,差异具统计学意义(P<0.05)。结论:本研究证实二甲双胍随着浓度的增加,对Hep G2细胞的细胞活力抑制增加,最佳剂量为10 m M;二甲双胍能显著抑制Hep G2细胞的迁移距离,且二甲双胍的细胞侵袭能力显著低于生理盐水组,流式结果显示二甲双胍显著增加Hep G2细胞的细胞凋亡;western blot检测到二甲双胍10 m M组P-AMPK、Atg14及自噬标记物LC3-Ⅱ表达明显升高。提示二甲双胍可能通过促进Hep G2细胞的自噬增加细胞凋亡,进而抑制Hep G2细胞的细胞活力、迁移以及侵袭,是临床上治疗肝癌的潜在药物。这些发现对于阐明二甲双胍在抑制肝癌细胞的作用机制上可能是有帮助的,值得进一步研究。研究背景:肝细胞癌(肝癌)是世界发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤,其中约50%以上的肝癌新发人数及死亡人数在我国。目前,手术切除仍是肝癌治疗的主要方式。腹腔镜下肝癌肝切除术相对于传统开腹手术,具有创伤小,术后恢复快,减少术后并发症,降低手术切口的感染率且极大缩短了患者术后住院时间等优点,因此,腹腔镜肝切除术逐渐在世界范围得到开展。近十余年,随着腹腔镜手术器械的改进和手术技术的进步,腹腔镜肝切除术得到了迅速的发展,很多禁区被逐一突破。腹腔镜下肝切除术追求以肝脏生理解剖为基础,在保证将主癌灶及其肝段内微转移灶完全切除的同时,最大限度保持剩余肝脏结构和功能完整并获得安全切缘。术中肝段解剖界限及肝切除范围的精准确定是成功实施腹腔镜下肝切除手术的先决条件。目前,腹腔镜肝切除术仍在探索阶段,技术推广受限的关键问题即目前缺乏精准的腹腔镜肝段标记方法。目前常用的肝段标记方法有:缺血线标记法、亚甲蓝标记法和肝脏表面标记法。但以上三种标记法均存在缺陷。由于肝脏呈凹凸不平的三维立体层面,肝实质内肝段或肝叶的解剖界线与肝表面界限并不是在同一个平面内,缺血线和肝脏表面标记仅在肝脏表面可见,离断肝实质时不可见,术中肝实质的断离面仍需通过肝静脉走行和术者经验判断,仅依靠肝脏表面缺血线和表面标记难以达到精准标记进而施行精准的解剖性肝切除术,加大了切缘阳性的风险。因此,寻找到有效的、安全的、稳定的、并且精准的腹腔镜肝脏分段标记方法,进而彻底切除肿瘤病灶是腹腔镜肝脏切除术的未来发展方向。吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)也叫靛氰绿,是一种近红外荧光造影剂,经特殊荧光采集系统摄取后则可再显像设备上显示荧光或彩色荧光,可用于组织和器官的显影。吲哚菁绿荧光染料生物安全性好,蛋白结合的ICG进入肝血窦后,主要由肝细胞特异性摄取,然后以原形通过毛细胆管排入胆道,不参与淋巴回流和肠肝循环。因此其在肝脏外科领域有广泛应用前景。ICG成像最早在肝脏外科的应用主要是手术前通过ICG清除率来评估肝功能。本世纪初,有研究显示ICG荧光显像能实时、高灵敏度地鉴别肝癌病灶,特别是小肝癌病灶,提高肝切除和手术分期的准确性。近年来,腹腔镜下吲哚菁绿荧光融合影像技术(indocyanine green Fluorescence imaging,ICG-FI)的出现,将腹腔镜术野和ICG荧光融合影像视野同步显示在同一屏幕上,通过注入ICG正染和负染技术,不仅可以获得肝脏表面而且能在肝实质内部确切持久的进行肝段荧光染色。解决了传统的腹腔镜肝切除术中肝段标记方法均存在缺陷,实现肝段的三维立体定位,清晰辨识且标记持续时间长,极大的促进了腹腔镜精准肝切除的临床应用。目的:1.探讨ICG-FI技术在腹腔镜肝癌肝切除术中的应用价值,及分析ICG-FI在确定肿瘤边界、肝段实时染色中的价值。2.回顾性分析、研究比较ICG-FI腹腔镜组和普通腹腔镜组在术前、围手术期、术后等相关指标间的差异,旨在进一步探明ICG-FI引导下腹腔镜的优势。3.分析ICG-FI腹腔镜组的并发症及安全有效性,评价ICG-FI技术在腹腔镜肝癌肝切除术中的临床应用价值。4.进一步分析正染法和反染法在ICG-FI引导腹腔镜肝癌切除中的价值。方法:1.本研究对自2017年4月至2020年1月间入住安徽医科大学第一附属医院肝胆胰外科一病区的22例接受ICG-FI腹腔镜肝切除手术的肝癌患者和38例接受普通腹腔镜肝切除手术的肝癌患者的临床资料,进行回顾性研究分析,以比较两组间临床数据的异同。2.计量资料数据进行正态性检验,符合正态分布的计量指标数据以均数±标准差(mean±SD)描述,非正态分布的计量指标数据以中位数(四分位数间距);ICGFI腹腔镜组和普通腹腔镜组进行两组间差异比较,符合正态分布的计量数据采用独立t检验,非正态分布的计量指标数据选用Mann Whitney非参数检验,卡方检验(χ2 test)或Fisher精确检验法用于计数资料比较,以p<0.05为有统计学差异。结果:1.患者的术前临床资料:本研究共纳入接受肝切除手术的60例肝癌患者的临床资料,其中ICG-FI腹腔镜组男性患者20例(90.9%),女性患者2例(9.1%),平均年龄57.50±10.09岁,普通腹腔镜组男性33例(86.8%),女性患者5例(13.2%),平均年龄59.42±10.65岁。两组患者在上腹部手术史、甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)指标、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBs Ag)指标、肝功能Child-Pugh分级、肝硬化、术前凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)、谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、血清白蛋白(albumin,Alb)之间无显著统计学差异(p>0.05)。2.ICG-FI腹腔镜组和普通腹腔镜组的患者肿瘤分布及施行的手术方式,两组数据间无明显统计学差异(p>0.05)。3.患者围手术期的相关资料:ICG-FI腹腔镜组中转开腹为2例,普通腹腔镜组中转开腹为6例,两组术中转开腹率(9.1%vs 15.8%,p=0.733)、术中失血量(261.90±148.24 vs 273.78±185.63,p=0.803)、围手术期输血率(27.3%vs 26.3%,p=0.936),肝门阻断率(59.1%vs 50.0%,p=0.496),肝门阻断时间[26.00(15.00-34.00)vs 26.00(15.00-33.00),p=0.688]无明显统计学差异。ICG-FI腹腔镜组在手术时间(225.45±35.71 vs 258.76±28.55,p=0.047),切缘阳性率(0 vs10.5%,p=0.032),并发症发生率(18.2%vs 36.8%,p=0.032)等指标优于普通腹腔镜组。4.两组患者在术后胆红素、ALT、AST的恢复呈下降趋势,Alb的恢复呈上升趋势。两组间无显著统计学差异(p>0.05)。在术后随访过程中,ICG-FI腹腔镜组3例肿瘤复发,普通腹腔镜组14例肿瘤复发,术后肿瘤复发率ICG-FI腹腔镜组优于普通腹腔镜组(13.6%vs 36.8%,p=0.045),二者的差异具有统计学意义。5.ICG-FI腹腔镜组中解剖性肝切除的荧光染色方式和结果:ICG-FI腹腔镜组中9例解剖性肝切除,其中正染法选择3例,失败1例,反染法选择6例,失败1例。结论:吲哚菁绿荧光融合影像(ICG-FI)引导腹腔镜肝切除具有重要的临床应用价值,本研究中,ICG-FI腹腔镜组22例患者全部实现肿瘤完整切除,相较于普通腹腔镜组有助于确定肿瘤边界,显著降低肿瘤切缘的阳性率,缩短手术时间,降低术后并发症发生率,减少了术后肿瘤复发。表明吲哚菁绿荧光融合影像(ICG-FI)引导腹腔镜肝切除具有良好的安全性,有着重要的临床应用价值,值得在肝胆外科广泛开展应用。另外,正染法和反染法适用于不同类型的肝脏切除,成功的关键在于精确掌握目标肝蒂的血供范围穿刺部位。