利用外源性或内源性神经干细胞(neural stem cell,NSCs)来进行脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)修复一直是一项世界级难题,这主要是因为处于损伤部位复杂微环境的神经干细胞倾向于分化为星形胶质细胞而不是神经元,分化的星形胶质细胞及其分泌物还可进一步形成胶质瘢痕,构成神经再生的物理和化学屏障。虽然目前已有多种策略可在损伤区域实现神经元的定向分化,但采用超微粒径阳离子碳量子点(cationic carbon quantum dots,CQDs)诱导NSCs定向分化为神经元,以此来促进脊髓损伤修复的研究尚未见报道。本课题首次研究了阳离子碳量子点除了依赖于其光学性质(如生物标记和生物成像等)和阳离子性质(如基因治疗和药物输送等)外对细胞分化命运的影响。本研究以枸杞寡糖(Lycium barbarum L.oligosaccharide,LBOS)为碳源,乙二胺和PEI为阳离子试剂,通过一步水热合成法制备出了超微粒径的阳离子碳量子点(~1nm)。体外实验表明,超微粒径的阳离子碳量子点可显著抑制NSCs向星形胶质细胞分化,并在不影响神经元分化的基础上,促进神经元向周围区域的延伸。体内实验表明,超微粒径阳离子碳量子点可在脊髓全横断损伤区域显著抑制内源性及外源性NSCs向星形胶质细胞分化,进而抑制胶质瘢痕增生,促进神经回路重建。综上所述,本研究通过体外及体内实验充分表明枸杞寡糖来源的超微粒径阳离子碳量子点可显著抑制NSCs向星形胶质细胞分化,从而指导神经干细胞定向分化为神经元。第一章综述本章以脊髓损伤为重点,着重介绍了脊髓损伤后损伤区域的病理性变化、脊髓损伤模型的构建、脊髓损伤的治疗方法以及最终治疗效果的评价。接着,围绕研究主体碳量子点的制备方法、光学性质及应用领域作简单介绍。在这个过程中,我们发现到目前为止,尚没有相关报道表明超微粒径阳离子碳量子点具有促神经干细胞定向分化神经元的作用。最后,提出本课题的设计思路及研究意义,为论文后续工作的开展奠定基础。第二章枸杞寡糖的提取纯化及初步表征本章主要介绍了碳量子点的碳源LBOS的提取纯化工艺和初步表征结果,即通过水提醇沉法、Seveg法、多级柱层析法从中药枸杞子中提纯枸杞寡糖,并借助高效凝胶渗透色谱、考马斯亮蓝蛋白含量检测、质谱及单糖组成检测对枸杞寡糖的纯度、分子量及单糖组成进行初步表征。结果表明,最终纯化得到的LBOS分子量分布集中,约为5个D-半乳糖所构成的寡糖,几乎不含残留蛋白和小分子杂质。第三章碳量子点的制备及表征本章以枸杞寡糖为碳源,乙二胺和PEI为阳离子试剂,通过一步水热合成法制备出了超微粒径的阳离子碳量子点,并通过紫外-可见光吸收光谱、荧光激发和发射光谱、红外光谱、琼脂糖凝胶电泳及高分辨透射电镜对碳量子点的光学性能、电荷性质及粒径大小进行表征。结果表明,本研究所制备得到的碳量子点是一种粒径低至1 nm左右的超微碳量子点,表面带有正电荷,可在不同波长激发光下发出不同颜色的荧光,即CQDs的荧光发射波长具有激发波长依赖性。第四章碳量子点体外介导神经干细胞定向分化神经元研究本章以枸杞寡糖为对照,以GFAP(星形胶质细胞标记)、Tuj1(未成熟神经元标记)、MAP2(成熟神经元标记)为指标通过免疫荧光法和Western Blot法检测超微粒径阳离子碳量子点在体外作用于神经干细胞后对神经干细胞分化方向的影响。最终结果显示,与对照组LBOS相比,以LBOS为碳源所制备的碳量子点可显著抑制NSCs向星形胶质细胞分化,并在不影响神经元分化的基础上,促进神经元向周围区域的延伸。接着,为了探究碳量子点制备过程中使用两种阳离子试剂的必要性,分别使用去离子水替代乙二胺或PEI,在相同的操作条件下制备得到了PEICQDs及乙二胺-CQDs,将这两种碳量子点作用于神经干细胞后,乙二胺-CQDs对神经干细胞的分化方向没有明显影响,PEI-CQDs则表现出明显的细胞毒性。这一结果充分表明使用两种阳离子试剂对修饰碳量子点的必要性。第五章碳量子点介导NSCs定向分化神经元的初步机制探究本章将碳量子点作用于高表达GFAP的星形胶质细胞来检测碳量子点对GFAP表达水平的影响,从而间接揭示碳量子点抑制NSCs分化为星形胶质细胞的潜在作用机制。具体而言,将碳量子点作用于高表达GFAP的星形胶质细胞8天后,通过免疫荧光染色来观察碳量子点对细胞中GFAP和β-tubulin表达水平的影响,其中β-tubulin作为细胞骨架蛋白,其表达范围和表达水平可反映细胞的生存状态,进而反映碳量子点对星形胶质细胞的毒性作用。结果显示,随着碳量子作用浓度的升高,越来越多的星形胶质细胞低表达或不表达GFAP,与此同时却对β-tubulin的表达没有明显影响。根据这一现象推测阳离子碳量子点进入星形胶质细胞后可特异性的与带负电的GFAP结合,影响GFAP的组装或解聚,从而抑制GFAP的表达水平。基于这一原因,我们推测当碳量子点作用于神经干细胞后,进入NSCs中的碳量子点将会特异性的结合神经干细胞趋向分化时初始表达的GFAP,影响GFAP的组装,从而影响神经干细胞向星形胶质细胞的分化。第六章碳量子点体内介导脊髓损伤修复研究本章通过碳量子点对大鼠全横断脊髓损伤模型的修复效果来评价碳量子点在体内指导神经干细胞分化的能力。具体而言,将包埋有碳量子点及外源性神经干细胞的纤维蛋白支架作用于全横断脊髓损伤大鼠并使其修复两个月后,以旷场轨迹实验和组织学染色来评价大鼠运动功能的恢复程度和损伤区神经元的再生状况。结果表明,在脊髓损伤处联合使用碳量子点和外源性神经干细胞时,碳量子点可明显诱导内源性和外源性神经干细胞向神经元分化,并实现损伤脊髓两端神经元的相互连接,为神经冲动的传导奠定细胞基础。更为重要的是,在其他各组大鼠后肢仍处于拖拽运动时,联合使用碳量子点和外源性神经干细胞进行治疗的大鼠,已可以实现短距离内后肢的协调步态行走。