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研究背景:前列腺癌(prostate, PCa)是常见的男性泌尿系统恶性肿瘤,在欧美国家的男性恶性肿瘤中,其发病率位居首位,死亡率位居第二。近年来,由于饮食结构的改变,老年男性平均寿命的增加,环境污染及人们生活压力逐渐增大,我国前列腺癌的发病率也在逐年升高。骨骼是其最易转移的部位之一,有超过80%的患者最终都会有骨转移的发生,大约30%～50%的患者在初诊时即有骨转移的发生,并且骨转移会出现严重的骨痛、病理学骨折、神经压迫等各种并发症,严重降低了患者的生活质量。近年来,随着现代医学模式向生物-心理-社会模式的转换,心理因素对疾病的作用越来越得到更多人的重视,尤其对于前列腺癌等恶性肿瘤患者,由于对癌症的惧怕及高昂的治疗费用,在漫长的诊疗过程中,患者总是被不同程度的精神心理压力所困扰。一些不良情绪如长期的紧张、焦虑、抑郁等,使患者处于一种长期的慢性心理应激状态。现代医学研究表明,慢性心理应激通过交感-肾上腺髓质系统(sympatho-adrenomedullary system,SAMS)及下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA),调节体内儿茶酚胺类物质分泌,从而促进体内细胞因子的分泌,调节机体的免疫,对前列腺癌的发生发展产生一定的影响。研究表明,白细胞介素6 (interleukin-6,IL-6)对许多肿瘤(如乳腺癌、卵巢癌和胃癌等)的发生发展具有重要作用,其对前列腺癌细胞的增殖转移等作用也已被大量研究所证实。然而慢性心理应激是如何调控IL-6的表达,是通过什么信号通路调控IL-6的表达?这些问题目前尚不是十分清楚。研究目的:体外培养人前列腺癌细胞,分别从基因水平和蛋白水平揭示儿茶酚胺类物质(异丙肾上腺素等)调控IL-6表达的信号通路;建立一种新颖的、使前列腺癌细胞特异性向骨骼转移的动物模型;通过束缚、摇晃等方法建立一种慢性心理应激动物模型,通过小鼠探索慢性心理应激对IL-6的表达影响,并对前列腺癌骨转移影响,为前列腺癌的临床综合治疗提供思路和方法。研究方法:本研究分为两部分:(1)体外培养人前列腺癌细胞PC3,将同一培养瓶中的细胞均匀接种到六孔板内,用异丙肾上腺素(Isoprenaline,ISO)和去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)处理不同时间后收取细胞,提取总RNA,通过实时荧光定量核酸扩增检(Real-time quantitative PCR,qPCR)IL-6表达,然后使用不同信号通路抑制剂预处理前列腺癌细胞,随后检测其表达是否发生变化,从转录水平揭示儿茶酚胺调控IL-6表达的信号通路;Western blot检测信号通路蛋白表达,从翻译水平揭示儿茶酚胺调控IL-6表达的信号通路;(2)通过股动脉注射建立骨转移小鼠模型,然后通过束缚、摇晃,湿润垫料等方法建立慢性心理应激小鼠模型。实验分为四组:A.对照组(control);B.应激组(stress); C.腹腔注射异丙肾上腺素组(ISO); D.应激加腹腔注射普萘洛尔组(stress+Pro)。股动脉注射前列腺癌细胞后三周,在活体状态下,对小鼠眼眶取血,通过酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测离心后的小鼠血清中IL-6含量,统计分析结果;随后处死小鼠,将注射前列腺癌细胞侧的下肢骨取出,多聚甲醛(4%,中性)固定24h,脱钙15天,石蜡包埋、切片,抗酒石酸酸性磷酸酶染色(Tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色,统计分析不同组别间的破骨细胞数量,苏木素-伊红染色(Hematoxylin and Eosin,HE)染色,观察统计不同分组间的肿瘤所占面积大小,所有实验结果由统计分析软件SPSS17.0比较各组间差异。实验结果:1.ISO和NE均能使IL-6表达明显上调(P<0.05),当使用Propranolol (非选择性β-受体阻断剂)和ICI118551 (β2-AR特异性阻滞剂)预处理前列腺癌细胞后,IL-6表达明显下调(P<0.05),而用阿替洛尔(Atenolol, ATEN, β1-AR阻滞剂)预处理前列腺癌细胞后其表达未发生明显变化(P>0.05) ,WP1066(STAT3抑制剂)和PD184352(ERK抑制剂)预处理后,IL-6表达无明显变化(P>0.05);而H89(AKT抑制剂)及GDC0941(PKA抑制剂)预处理前列腺癌细胞后,IL-6表达均明显下降(P<0.05); Western blot结果显示,异丙肾上腺素使P-AKT抗体蛋白表达明显上调(P<0.05),当使用非选择性β受体阻滞剂普萘洛尔、β2受体阻断剂ICI118551预处理前列腺癌细胞后,其表达则出现明显下降(P<0.05),使用PKA抑制剂GDC0941预处理前列腺癌细胞后,其表达亦明显下调(P<0.05)。2.TRAP染色结果显示,与对照组比较,腹腔注射ISO组小鼠下肢骨中破骨细胞数量明显增多(P<0.05),应激组与腹腔注射ISO组间的结果类似,且两组之间无明显差异(P>0.05);与应激组比较,而应激加腹腔注射普萘洛尔组破骨细胞数量明显减少(P<0.05);HE染色发现,与对照组相比,应激和腹腔注射ISO组小鼠下肢骨中肿瘤细胞面积明显增大(P<0.05);而两组之间无明显差异;与应激组相比,应激加腹腔注射普萘洛尔组肿瘤面积明显减小(P<0.05); ELISA检测发现,与对照组比较,腹腔注射ISO组小鼠血清中IL-6含量明显增加(P<0.05),应激组结果与之类似,且两组间无明显差异(P>0.05);与应激组比较,应激加腹腔注射普萘洛尔组IL-6含量明显降低(P<0.05)。实验结论:1.异丙肾上腺素可上调前列腺癌细胞IL-6的表达,通过β2-AR-AKT-PKA信号通路调控其表达;2.股动脉注射法建立的前列腺癌骨转移动物模型,转移成功率较高,特异性地转移至小鼠下肢骨,避免了除骨之外的其他远处转移造成的干扰,为我们研究前列腺癌骨转移机制提供了有利条件。3.慢性心理应激加速白细胞介素6等细胞因子的分泌。4.慢性应激使破骨细胞数量增加,打破骨代谢平衡,使骨质溶解,从而促进前列腺癌的骨转移。