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目的: 研究在卵巢癌细胞系中,1,25(OH)2D3对顺铂化疗敏感性的影响,探讨其可能的调控机制。 材料和方法: 1.用MTT检测1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞A2780,ACP(A2780/DDP),OV2008,C13K(OV2008非获得性顺铂耐药细胞系),ES2,SKOV3,HO8910的细胞毒性。 2.用EDU染色观察1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞增殖的影响,及集落成形实验观察1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响。 3.用划痕实验观察1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞迁移的影响。 4.用MTT检测:1,25(OH)2D3联用顺铂与单独使用顺铂相比,卵巢癌细胞对顺铂耐药性(IC50:半数致死量)的变化。利用药物作用软件Compusyn计算,1,25(OH)2D3与顺铂联用时的CI值(药物联合作用指数)。 5.将卵巢癌细胞分为四个处理组:空白组,1,25(OH)2D3组,顺铂组,顺铂+1,25(OH)2D3组。用 Hochest33342和流式细胞仪检测染色观察1,25(OH)2D3联合顺铂对卵巢癌细胞凋亡的影响。 6.将卵巢癌细胞ES2分为四个处理组:空白组,1,25(OH)2D3组,顺铂组,顺铂+1,25(OH)2D3组,用Western Blot检测各组耐药相关蛋白(BRCA1,EZH2及H3K27me3,MLH1)和凋亡相关蛋白(P73,P53,Caspase-3,Caspase-9),VDR,及总蛋白内参β-actin和核蛋白内参基因H3的表达情况。 7.对卵巢癌细胞ES2,利用慢病毒转染沉默EZH2的短发夹RNA(shRNA),筛选EZH2低表达稳转细胞株(shEZH2),用PCR和Western Blot检测细胞的转染效率。然后,用MTT检测调控EZH2前后,单用顺铂和联用1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞ES2耐药性的影响。及Western Blot检测经EZH2下调处理前后,1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞EZH2,H3K27me3,P53的影响。 结果: 1.1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞的细胞毒性作用在72h内逐渐增强,浓度在10-7-10-10mol/l内随着浓度的增加而增强。其中ACP和ES2经过10-8mol/的1,25(OH)2D3处理48h后,增殖受到抑制。 2.1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞的迁移没有明显作用。 3.1,25(OH)2D3联用顺铂后IC50与单用顺铂的IC50相比,除了HO8910无明显改变(P=0.681),卵巢癌其他细胞均对顺铂的敏感性明显增加(P<0.05),并且两种药物之间以协同作用为主(CI<1)。 4.用 Hochest33342染色观察到:1)1,25(OH)2D3组与空白组相比,卵巢癌细胞没有明显凋亡小体形成;2)1,25(OH)2D3联用顺铂组与单用顺铂组相比,其中A2780,ACP,ES2活细胞数量明显减少,出现典型的凋亡小体。 5.用流式检测各处理组的细胞凋亡情况:1)1,25(OH)2D3组与空白组相比,对ACP细胞无明显促凋亡作用(P=0.194),而ES2有明显促凋亡作用(P=0.034);2)1,25(OH)2D3联用顺铂组与单用顺铂组相比,ACP细胞的凋亡率差异无统计学意义;ES2细胞,凋亡率分别为:37.83%±6.28%和13.93%±0.23%,联合用药组凋亡率显著升高(P=0.003)。 6.用Western Blot检测结果为:1)ES2细胞经1,25(OH)2D3处理48h后,耐药相关蛋白:BRCA1、 MLH1表达升高,EZH2表达降低,并伴随着H3K27三甲基化水平的降低,凋亡蛋白: P73,P53,Caspase-9和Caspase-3均表达升高,及维生素D受体(VDR)的表达升高。2)1,25(OH)2D3联用顺铂组与单用顺铂组相比,耐药蛋白:BRCA1,MLH1表达升高,而EZH2和H3K27me3水平降低,而凋亡蛋白只有P53出现表达升高。其中1,25(OH)2D3介导的EZH2下调,具有时间依耐性。 7.在ES2细胞中,经RT-PCR和Western Blot验证,慢病毒转染细胞的EZH2表达明显下调。下调EZH2后,1,25(OH)2D3对顺铂耐药性的影响不明显,P53表达上升。 结论: 1,25(OH)2D3可以抑制卵巢癌细胞的增殖,提高顺铂介导的卵巢癌细胞凋亡,从而提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,其机制可能是由EZH2和P53的介导。